奶牛结核杆菌病检测方法的研究

俞小红

（苏州市畜牧兽医站，江苏苏州 215128）

近年来，随着人们生活水平的日益提高，人们对牛肉、奶制品，特别是牛奶的需求与日俱增，为了保证百姓能喝上放心奶，各级政府高度重视，出台了一系列净化奶牛结核病的政策和措施。据统计，人结核病有10%以上由牛分支杆菌引起，我国是世界上结核病发病较严重的国家。因此，牛结核病的传染流行严重影响到畜牧业的持续健康发展，更严重威胁着人类的健康。

本文对苏州地区部分奶牛场结核杆菌病检测方法进行了比较研究，为摸清适合本地区奶牛结核杆菌病的检测方法提供科学依据。

1 材料和方法

1.1 研究材料

1.1.1 仪器设备

酶标仪、烘箱、离心机、微量震荡器、水浴箱、游标卡尺等。

1.1.2 试验材料

（1）试剂：国产牛型提纯结核菌素（PPD），购自哈药集团生物疫苗有限公司，50头份/瓶；BOVIGAMTM牛结核分支杆菌γ-干扰素检测试剂盒；由华中农业大学动物医学院提供。

（2）试验动物：吴中区、相城区、常熟市的重点阳性奶牛场。根据试验需要并结合牛场实际，本试验共选取了478头奶牛作为试验样本。

1.2 试验内容和方法

1.2.1 试验内容

奶牛结核杆菌病检测：分别用牛型结核分支杆菌（PPD）皮内变态反应和BOVIGAMTM IFN-γ（γ-干扰素）试验检测牛结核病，来比较皮内变态反应和γ-干扰素检测这2种方法的优缺点。

1.2.2 检测方法

（1）牛型结核分支杆菌PPD皮内变态反应试验：参照国家标准《动物结核病诊断技术（GB/T18645-2002）》进行。

（2）BOVIGAMTM IFN-γ（γ-干扰素）试验：具体操作按试剂盒说明书进行。

2 结果与分析

（1）用牛结核分支杆菌PPD皮内变态反应和BOVIGAMTM IFN-γ（γ-干扰素）试验分别对478头奶牛进行了牛结核杆菌的检测，两种方法的检测结果见表1。

表1 牛结核分支杆菌PPD皮内变态反应和IFN-γ体外释放检测（牛型和禽型）的比较

（2）两种检测方法的比较：从表1中可以看出，82头牛结核菌PPD皮内变态反应阳性牛中检出IFN-γ牛型结核阳性41头，禽型结核13头。396头牛结核菌PPD皮内变态反应阴性牛中检出IFN-γ干扰素牛型结核阳性58头，禽型结核9头，阴性牛329头。牛结核菌素PPD皮内变态反应的阳性检出率为17.2%（82/478），IFN-γ干扰素试验牛型结核阳性检出率为20.7%（99/478）；2种方法的阳性符合数为41头，阳性符合率为45.3%（82/181）；阴性符合数为329头，阴性符合率为87.4%（658/753）。两者的总体符合率为77.4%（370/478）。

以IFN-γ干扰素试验作为结果判定标准，99头IFN-γ干扰素试验阳性牛中，牛结核菌PPD皮内变态反应检出的阳性牛为41头，敏感性为41.4%（41/99）；357头IFN-γ干扰素试验阴性牛中牛结核菌PPD皮内变态反应检出的阴性牛为329头，特异性为92.2%（329/357）。

3 小结与讨论

（1）通过牛结核菌PPD皮内变态反应和IFN-γ干扰素试验2种方法的比较（表1），可以看出，IFN-γ干扰素试验阳性检出率高于PPD反应，且能区分牛型和禽型感染，PPD反应敏感性较IFN-γ干扰素试验低，无法排除禽型、副结核等其他分支杆菌的干扰，两者的阴性符合率为87.4%，表明2种方法具有较好的阴性符合率。

目前，我国牛结核病检疫，主要采用牛型PPD进行皮内变态反应，但从表1检测数据来看存在一定比例的禽结核感染，是由禽结核分枝杆菌感染引起的假阳性。主要是由于PPD反应所用的诊断试剂结核菌素纯蛋白衍生物（PPD）是多种抗原的混合物，存在交叉反应导致非特异性阳性反应。若单独用该方法检出PPD阳性牛即实行“检疫-扑杀”淘汰措施，会导致部分假阳性牛被误杀。同时该方法敏感性（41.4%）较低，在疫病的早期阶段和急性感染病例会发生假阴性反应[1]，又会导致扑杀不净。故OIE认为仅用单一的结核菌素试验进行结核病净化很难[2]，而且PPD反应由于受迟发型变态反应的影响，在30 d内不能进行复检，易造成该病的扩散和疫情处置的延误，IFN-γ干扰素试验则不存在复检时间的限制。

（2）从表1中可以看出，PPD皮内变态反应在实际检测中的敏感性相对比较差。实际操作中，牛型结核菌素的质量、剂量、结果判定标准及操作方法等因素均受主观判断影响。但该方法比较成熟，检测起来较直观，不需要精密的试验仪器和特殊的实验条件，临床实用性和可操作性比较强，因此，适用于在基层应用和结核病的普查初筛工作。

IFN-γ干扰素试验是检测血浆中抗原含量的一种方法。刺激淋巴细胞所用的抗原是结核分枝杆菌中存在的特异性抗原，有牛型和禽型之分，可以有效区分牛分支杆菌和环境中禽的干扰[3]，因该方法有较高的特异性；而由特异性抗原进行刺激所产生的γ干扰素的量直接反映机体是否接触过结核杆菌，因此，具有较高的敏感性[4]。该方法克服了皮试变态反应的主观性和禽型的干扰，而且阳性检出率高，但成本较高，需要一定的实验条件和检测技术，对于我国基层检疫不适用，难以推广应用，故在一定的条件下，特别是针对重点阳性牛场、普查和引进新奶牛时，可将PPD和抗原特异性IFN-γ干扰素检测方法联合应用于奶牛结核病的检疫，将有效提高检测方法的特异性和准确度，减少不必要的经济损失。

（3）我们通过对苏州地区部分奶牛场结核杆菌检测方法的优缺点分析和临床检测应用的比较，为摸清适合本地区奶牛结核病的检测方法提供了可靠的科学依据，为解决近年来奶牛结核病检测和净化方法的难题提供了有效的途径。通过2种检测方法的联合运用可以有效降低由于检测结果的误判导致的假阳性和假阴性造成的误杀奶牛数量和扑杀不净现象，并可大大减少由此带来的经济损失。进一步做好检疫、早隔离淘汰阳性牛和净化工作，将有效促进结核病的净化及健康奶牛群的建立，从而更好的服务于社会。

[1]徐贤坤.两种奶牛结核病检测方法的比较[J].畜牧与兽医，2010，42（2）：33.

[2]世界动物卫生组织.陆生动物诊断试验和疫苗手册（哺乳动物、禽鸟和蜜蜂）[M].北京：农业部畜牧兽医局，中国动物卫生与流行病学中心，2007.

[3]Alicia A，Lucia DE，Bezos J，et al.Assessment of diagnostic tools for eradication of bovine tuberculosis in cattle co-infected with Mycobacterium bovis and M.avium subsp[J].Paratuberculosis Vet Res，2006，（37）：596-606.

[4]邓铨涛，陈颖玉，郭爱珍，等.奶牛结核病诊断方法的比较研究.生物技术通报，2009，（3）：84-87.