外周血中PIPmRNA的表达及在乳腺癌微转移中的临床意义

孙淑明 林豪雨 卢晓峰 梁伟全 谢舜峰

（汕头大学医学院第一附属医院甲状腺乳腺外科，广东 汕头 515041）

外周血中PIPmRNA的表达及在乳腺癌微转移中的临床意义

孙淑明 林豪雨 卢晓峰 梁伟全 谢舜峰

（汕头大学医学院第一附属医院甲状腺乳腺外科，广东 汕头 515041）

目的 探讨泌乳素诱导蛋白( PIP) mRNA对乳腺癌微转移的临床价值。方法 采用逆转录-多聚酶链反应（RT-PCR）技术检测75例乳腺癌患者、21例乳腺良性病变患者和20例健康者外周血中PIPmRNA的表达情况。结果 75例乳腺癌患者外周血中PIP mRNA有23例表达，阳性率为30.7%，乳腺良性肿瘤组和对照组中PIP mRNA表达为阴性。两组比较差异有显著性（P＜0.05）。PIPmRNA 阳性表达与患者的淋巴结转移状况、原发肿瘤大小、分期显著相关（P＜0.05）；而与患者的年龄、病理类型、ER、PR 等无显著相关（P＞0.05）。结论 外周血PIP mRNA阳性表达与乳腺癌微转移有关。

泌乳素诱导蛋白；逆转录聚合酶链式反应；乳腺肿瘤；微转移

Fisher等认为乳腺癌是一种全身性疾病的局部表现，治疗效果取决于确诊时有无远处转移，转移和复发是乳腺癌致死的主要原因。若在亚临床阶段就能检测到微转移，那么对指导临床的治疗和判断患者的预后都具有重要的实际意义。我们应用RT-PCR法，检测乳腺癌患者外周血中PIP mRNA的表达，探讨PIP mRNA与乳腺癌微转移之间的关系，从而为临床上诊断乳腺癌微转移提供指导意义。

1 资料与方法

1.1 临床资料

收集2007年8月至2010年7月在我院住院，经病理确诊的乳腺癌75例（女性74例，男性1例），平均年龄48.5岁（28～82岁）。浸润性导管癌63例、髓样癌4例、导管原位癌4例、黏液腺癌3例、粉刺癌1例。按TNM分期：Ⅰ期8例、Ⅱ期47例、Ⅲ期15例、Ⅳ期5例。同期采集21例乳腺良性肿瘤患者和20例健康者（无乳腺疾病及其他肿瘤病史的女性）。全部患者在入院治疗前均未行任何抗肿瘤治疗，且具有完整的病理及病历资料。

1.2 试剂及引物

逆转录试剂盒、Premix Taq和DNA Marker （大连宝生物公司）；引物由美国Invitrogen公司合成。PIPmRNA[1]的预期扩增片段为172 bp；上游引物：5'-GGCCAACAAAGCTCAGGACAAC-3'，下游引物：5'-TGCA CCTTGTAGAGGGATGCTG-3'。

1.3 方法

1.3.1 标本采集及保存：清晨空腹抽取外周浅静脉血6 mL，立即加入EDTA抗凝试管，在2 h内提取外周血单个核细胞，在液态氮中速冻15 min后放入-80 ℃冰箱中保存待用。全部按严格无菌操作采集标本。

1.3.2 RT-PCR反应：按一步法提取总RNA（TRIZOL法），根据逆转录试剂盒、PremixTaq说明书介绍的方法严格操作。用乳腺癌组织的cDNA作为阳性对照，去离子水作为阴性对照。

1.3.3 产物鉴定：由上海生工生物工程公司对PIPmRNA的PCR产物进行纯化、测序并鉴定。

1.4 统计学处理

用SPSS 16·0统计软件，计数资料采用χ2检验、一致性检验用Kappa值分析、等级资料用Kendall进行分析。

2 结 果

2.1 PIP mRNA的阳性表达：75例乳腺癌患者外周血标本中，有23例出现阳性表达，其阳性表达率为30.7%。乳腺良性肿瘤21例和健康对照组20例的外周血中均没有表达，差异有统计学意义。PIPmRNA在各组中的表达情况（表1）。

表1 PIPmRNA在各组的表达情况

2.2 PIP mRNA 的阳性率与乳腺癌预后的关系

癌瘤的大小、临床分期及淋巴结转移与PIP mRNA 的阳性率成正相关关系。PIP mRNA 的阳性率随癌瘤直径的增大而明显升高，在癌瘤直径≤2 cm、2.0～5.0 cm及≥5 cm中，PIP mRNA的阳性率为12.5%、59.6%及75.0%，差异有显着性（P＜0.05）；临床Ⅲ～Ⅳ期患者PIP mRNA的阳性表达率为60.0%（12/20），显著高于Ⅰ、Ⅱ期的12.5%和19.1%（P＜0.05）（表2）。PIP mRNA的阳性表达率与患者病理类型、年龄、月经状况未见有显著性关系（表3）。 PIPmRNA的表达与临床分期的关系见表2。

表2 乳腺癌组PIPm RNA的表达与TNM分期的关系

2.3 乳腺癌组PIPmRNA的阳性率与临床病理学特征的关系

见表3。

表3 乳腺癌组PIPmRNA的表达与临床病理参数的关系

2.4 测序结果

由上海生工生物工程公司对PCR产物做纯化、测序，用GenBank基因序列作同源性对比，扩增产物为目的基因得到证实。

3 讨 论

Fisher通过大量的实验和临床研究明确指出乳腺癌在确诊时约50%己有微小转移病灶，即使早期乳癌也可能是全身性疾病。乳腺癌死亡的主要原因是复发和转移，如果能在亚临床阶段发现与乳腺癌复发、转移密切相关的肿瘤标志物，并对其进行风险评估和早期干预，则对提高乳腺癌患者的生存率、降低病死率具有重要临床意义。

外周血微转移的检测以其能反复采集标本，检查方法简单，准确性高，便于随访监测等优点而受到重视。通过检测外周血特异性标志物来诊断乳腺癌微转移，成为目前研究热点之一。PIP被认为是一个特异性强且高度敏感的顶质分泌细胞标志物[2]，该蛋白基因位于人7号染色体q34位点，能与CD4+T细胞受体结合，从而抑制CD4介导的T细胞程序性死亡。近年来，RT-PCR法因高灵敏性而常常用于做为对各种实体瘤微转移的检测方法[3,4]。Ring等[5]报道通过实时荧光定量PCR法检测，将PIP作为检测乳腺癌患者循环肿瘤细胞的标志物之一。我们用RT-PCR方法对75例乳腺癌患者外周血中PIPmRNA检测，结果有23例检出有特征性172 bp扩增条带，阳性率为30.7%（23/75），而乳腺良性21例和健康者20例外周血均未查出有PIP mRNA，特异性 100%，跟文献报道相一致。

近年研究表明，PIP 基因或蛋白高表达可作为乳腺癌特异标志物，用于预测早期微小转移，并提示生存预后不佳[6-8]。将本实验75例乳腺癌患者分为有腋窝淋巴结转移和无腋窝淋巴结转移2组进行分析，结果有腋窝淋巴结转移者 PIPmRNA 的阳性率为66.7%，无腋窝淋巴结转移者的阳性率为10.0%，即伴有淋巴结转移者，PIPmRNA的阳性表达率高于无淋巴结转移者（P=0.006）。说明乳腺癌患者外周血PIPmRNA阳性率与腋窝淋巴结转移状况有显著性相关，外周血中PIP mRNA阳性表达在一定程度上能够反映疾病的分期，而腋窝淋巴结状态是乳腺癌预后的重要指标之一，也进一步阐明微转移与复发、预后的关系。Mitas等[9]采用RT-PCR对17个有腋窝淋巴结转移和51个无转移的淋巴结作对照进行检查，结果PIP的准确率为93.3%，认为PIP具有检测乳腺癌微小转移的潜在价值。郑振东等[10]对50例乳腺癌患者外周血标本中，化疗前17例PIP mRNA阳性的患者，经2～3个周期化疗后有13例转为阴性，其转阴率为76.5%，而在化疗前PIPmRNA表达阴性的患者经化疗后全部无转为阳性病例，化疗前、后有统计学差异（P=0.001）。由此可见，乳腺癌患者术后辅助化疗能够降低血液PIP mRNA的阳性率，有望减少乳腺癌血液微转移的发生。因此，动态监测乳腺癌患者外周血中PIP mRNA表达，对于指导临床治疗、治疗效果的判断及预测预后具有实际临床意义。

临床资料表明，乳腺癌病期越晚，出现转移的机会越大，治疗效果越差。我们75例资料显示：Ⅲ、Ⅳ期乳腺癌患者外周血PIP mRNA的阳性表达率（60%）明显高于Ⅰ（12.5%）、Ⅱ期（19.1%）患者（P=0.048＜0.05），可见病程越晚，出现远处转移的可能性也越大，同时Ⅰ、Ⅱ期乳腺癌分别有12.5%和19.1%的阳性表达，提示早期乳腺癌也存在远处转移的可能，这也能解释为什么部分早期乳腺癌患者预后较差的原因，因此临床上在制订治疗方案前尽可能对是否存在微转移作出诊断，有针对性制订出多学科综合的治疗方案，提高乳腺癌的治疗效果。

本研究也显示乳腺癌患者外周血中PIP mRNA表达除与肿瘤大小、淋巴结转移、TNM分期有关外，与患者年龄、月经状况、病理类型、肿瘤分化程度、ER、PR及HER-2等表达无关。PIP mRNA表达下调可显著抑制乳腺癌细胞的迁移、黏附和侵袭能力，提示PIP mRNA与乳腺癌细胞的转移潜能密切相关，其发挥作用的机制有待进一步研究。相信随着人们对PIP mRNA在肿瘤细胞中功能和作用机制研究的不断深入，必将为以PIP mRNA为靶点的抗肿瘤治疗带来希望。

[1] 韩正祥,张敬川,杜秀平,等.乳腺癌患者外周血中 PIP mRNA检测的临床意义[J].中华肿瘤防治杂志,2006,13(21):1635-1637.

[2] Jones C,Damiani S,Wells D,et a1. Molecular cytogenetic comparison of apocrine hyperplasia and apocrine carcinoma of the breast [J]. Am J Pathol,2001,158(1):207-214.

[3] RajGV,Moreno JG,GomellaL G. Utilization of polymerase Chain reaction technology in the detection of solid tumors[J]. Cancer, 1998,82(8):1419-1442.

[4] 耿强,王水,范萍,等.乳腺癌前哨淋巴结和骨髓和外周血微小转移的联合检测[J].肿瘤防治杂志,2005,2(12):85-88.

[5] Ring AE,Zabaglo L,Ormerod MG,et al. Detection of circulating epithelial cells in the blood of patients with breast cancer: comparison of three techniques[J]. Br J Cancer,2005,92(5):906-912.

[6] Honma N,Takubo K,Akiyama F,et al. Expression of GCDFP-15 and AR decreases in larger or node-positive apocrine carcinomas of the breast[J]. Histopathology,2005,47(2):195-201.

[7] Fritzsche FR,Thomas A,Winzer KJ,et al. Co-expression and prognostic value of gross cystic disease fluid protein 15 and mammaglobin in primary breast cancer[J]. Histol Histopathol,2007, 22(11):1221-1230.

[8] Chia SY,Thike AA,Cheok PY,et al. Utility of mammaglobin and gross cystic disease fluid protein-15(GCDFP-15) in confirming a breast origin for recurrent tumors[J]. Breast,2010,19(5):355-359.

[9] Murphy KM,Nelson CA,Sedy JR. Balancing co-stimulation and inhibition with BTLA and HVEM[J]. Nat Rev Immunol,2006,6 (9):671-681.

[10] 郑振东,于观贞,王杰军.乳腺癌患者辅助化疗前后外周血中PIPmRNA表达变化的研究[J].临床肿瘤学杂志,2009,14(3):203-206.

Clinical Significance of PIPmRNA Expression of Peripheral Blood in Micrometastasis of Breast Cancer

SUN Shu-ming, LIN Hao-yu, LU Xiao-feng, LIANG Wei-quan,XIE Shun-feng
(Department of Thyroid and Breast Surgery, the First Affiliated Hospital of Medical College of Shantou University, Shantou 515041, China)

Objective To assess the prognosis values of prolactin-induced protein(PIP) mRNA in breast carcinoma and tumor micrometastasis. Methods Peripheral serum samples of 75 patients with breast carcinoma, 21 patients with benign breast lesions and 20 controls were collected, PIP mRNA was assessed by RT-PCR. Results The positive rate of PIPmRNA in breast carcinoma patients, benign breast lesions and controls group was 30.7%, 0% and 0%. Significant differences were found in the expression of PIPmRNA in peripheral serum among patients with control groups, benign breast lesions patients with breast carcinoma (P＜0.05). The positive rates and related of PIPmRNA was significantly correlated with clinical stage (P＜0.05). There were no significant differences among any of age,histopathology types,estrogen receptor and progesterone receptor(P＞0.05). Conclusion Breast carcinoma and tumor micrometastasis patients with positive PIP mRNA was a close relationship.

Prolactin-induced protein; Reverse transcription polymerase chain reaction; Breast neoplasms; Tumor micrometastasis

R737.9

：B

：1671-8194（2014）05-0005-03

汕头市科技局资助项目（2011-181）