脑创伤后依达拉奉联合单唾液酸四己糖神经节苷脂对大鼠神经行为学影响的近期观察

尹立国，王金林，张中原，徐兴华，龙海成

（1.遵化市人民医院神经外科，河北唐山064200；2.唐山市工人医院神经外科，河北唐山063000）

脑创伤后依达拉奉联合单唾液酸四己糖神经节苷脂对大鼠神经行为学影响的近期观察

尹立国1，王金林2，张中原1，徐兴华1，龙海成1

（1.遵化市人民医院神经外科，河北唐山064200；2.唐山市工人医院神经外科，河北唐山063000）

创伤性脑损伤（Traumatic brain injury，TBI）有较高发生率，是导致创伤病人伤残及死亡的主要原因，严重危害人类健康，给社会和家庭带来沉重负担。创伤后如何更好保存患者神经功能是临床工作者和基础研究工作者面临的重大课题。线粒体和细胞膜在脑创伤后神经细胞恢复过程中挥重要作用，本研究运用改进的Marmarou方法建立大鼠弥漫性脑损伤模型，以依达拉奉（Edaravone）和单唾液酸四己糖神经节苷脂（GM－1）进行治疗干预，证明其神经保护的重要作用。

1 材料与方法

1.1 脑创伤模型的制备与分组

雄性成年SD大鼠110只（体重300－350g，购自北京维通力华公司，清洁级，自然光照，环境安静，温度适中，大鼠自由进食水，饲养1周后进行实验），随机分为实验对照组、颅脑创伤组、依达拉奉治疗组（Edaravone组）、单唾液酸四己糖神经节苷脂治疗组（GM－1组）、依达拉奉联合单唾液酸四己糖神经节苷脂治疗组（联合治疗组）。每组设伤后1h、6h、24h、48h、72h5个时相点。对照组每个时相点2只大鼠，创伤组和依达拉奉干预组、单唾液酸四己糖神经节苷脂治疗组、依达拉奉联合单唾液酸四己糖神经节苷脂治疗组每时相点5只大鼠。动物置乙醚麻醉缸中，以乙醚吸入方式深度麻醉动物，麻醉后的大鼠俯卧于落体致伤海绵垫上，70%酒精消毒颅顶部皮肤，沿正中线矢状切开头皮，剥离骨膜，显露人字缝与冠状缝，将一不锈钢垫固定在大鼠冠状缝与人字缝之间将大鼠头部固定于打击模型架下的头部固定装置中，重450g，直径18mm的铜柱沿垂直玻璃管于1.2m高度自由落下，撞击大鼠颅骨顶部的钢垫，造成大鼠中度弥漫性颅脑损伤。撞击后即刻移开大鼠，以免铜柱反弹造成头部二次打击伤。给予颅脑损伤后大鼠，头皮切口常规消毒、缝合。对照组仅给予相同的麻醉处理及沿中线矢状切开头皮、剥离骨膜、在冠状缝与人字缝之间粘钢垫，置致伤海绵垫上，但不行自由落体致伤，而后常规消毒、缝合切口。各组未到规定时相死亡的大鼠予以剔除（创伤组6h时相点、48h时相点、依达拉奉24h时相点、单唾液酸四己糖神经节苷脂治疗组6h时相点、依达拉奉联合单唾液酸四己糖神经节苷脂治疗组48h时相点各一只）。

1.2 给药方法

Edaravone治疗组给予Edaravone 10mg／kg，单唾液酸四己糖神经节苷脂治疗组给予单唾液酸四己糖神经节苷脂10mg／kg。对照组、颅脑损伤（TBI）组给予等量生理盐水。注射方法为伤后10 min，尾静脉注射，每24h注射1次。

1.3 细胞色素c检测

标本甲醛固定，石蜡切片，按武汉博士德提供细胞色素c检测试剂盒说明书方法进行检测。

1.4 原位细胞凋亡检测（TUNEL法）

按Roche公司提供TUNEL检测试剂盒进行操作。

1.5 神经行为学检测

取进行免疫组化组大鼠72h时相点，大鼠进行麻醉处死前进行检测。根据Rancan等［1］设计的3种感觉运动功能测试方法来评价动物DBI后神经生理功能的缺陷程度，每项重复3次，满分24分。

1.6 阳性细胞免疫反应强弱结果分析

采用Motic Med 6.0计算机真彩色图象分析系统以平均光密度进行半定量分析。

1.7统计学处理

实验数据用SPSS11.5进行统计学处理。计量资料以均数±标准差（¯x±s）表示，多组间同一时间点及同一组中不同时间点比较采用单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 创伤组Ctyc免疫反应在伤后6h即升高，伤后24h达高峰，以后迅速下降，Edaravone治疗组、单唾液酸四己糖神经节苷脂治疗组、依达拉奉联合单唾液酸四己糖神经节苷脂治疗组与创伤组比较明显降低，在24h、48h、72h差异显著（P＜0.01，表1）。

2.2 伤后1小时即可见少量凋亡细胞，以后凋亡细胞数逐渐增多，并于48h达高峰，Edaravone、单唾液酸四己糖神经节苷脂、依达拉奉联合单唾液酸四己糖神经节苷脂明显降低脑创伤后大鼠大脑皮质神经细胞凋亡数，与创伤组比较在24h、48h、72h有显著性差异（P＜0.01，表2）。

2.3 Edaravone、单唾液酸四己糖神经节苷脂及依达拉奉联合单唾液酸四己糖神经节苷脂干预后，DBI后72h大鼠的神经生理功能的缺陷程度明显改善（P＜0.01，表3）。）

表1 大脑创伤后大脑皮质cyt－c表达动态变化（¯x±s）

表2 大鼠脑创伤后大脑皮质神经凋亡数的动态变化（¯x±s）

表3 脑创伤后3天各组神经行为学评分比较（¯x±s，n＝22

3 讨论

机体在生理状态下，自由基产生与清除间保持着动态平衡［2－4］。脑创伤后，线粒体在导致组织损伤的分子事件中作用至关重要［5］。由于颅内压增高，血管痉挛及呼吸紊乱等，产生能量代谢障碍，由线粒体呼吸链和胞浆酶系（如黄嘌呤氧化酶）产生大量自由基，导致氧化应激。近年来Crompton［6］论述了ROS的形成增多导致线粒体膜通透性转换孔（PTP）开放。PTP开放后可导致细胞坏死和凋亡［6－9］。Lewen A［10］等也认为TBI后氧自由基产生增加可以导致线粒体功能紊乱，增加的氧自由基与钙离子相互作用导致线粒体膜渗透性转换孔开放，细胞色素c（Cytc）从损坏的线粒体释放，通过caspase依赖方式，诱导细胞凋亡。

神经节苷脂是一种酸性鞘糖脂，广泛存在于脊椎动物细胞膜、神经组织等结构中，其主要活性成分是GM－1。在缺血、缺氧的病理过程中，脑内GM－1含量下降［11］。因此脑损伤后补充外源性神经节苷脂对维持细胞膜结构和功能的完整性极其重要。Edaravone（3－methyl－1－phenyl－2－pyrazolin－5－one）是近年来开发上市的新型脑保护剂和自由基清除剂。一项关于心肌缺血再灌注的实验证明Edaravone能作用于线粒体膜通透性转换孔（MPTP），能减少心肌细胞凋亡以及减轻线粒体的肿胀程度［12］。本研究应用Marmarou脑创伤模型，在我们的实验结果中，Edaravone和GM－1均能降低由线粒体释放的Cytc的表达并减少脑创伤后的神经细胞凋亡数量，达到其脑保护的作用，联合组效果更为显著。其可能的作用机制为：依达拉奉减少自由基生成，起到了保护神经细胞膜完整性作用，有利于GM－1嵌入神经细胞膜，GM－1嵌入神经细胞膜后恢复Na＋－K－ATP酶、Ca2＋－Mg2＋ATP酶活性，防止钙超载，改善线粒体功能及受损细胞的能量代谢，对多种炎性因子及细胞因子的表达起其调控作用，对依达拉奉起正反馈作用［13］。本研究经Edaravone和GM－1干预后，DBI后72h大鼠的神经生理功能的缺陷程度明显改善，联合应用Edaravone和GM－1治疗效果更为明显。说明Edaravone和GM－1脑创伤后继发性损伤调节中发挥着协同保护神经细胞的重要作用。脑创伤后联合应用Edaravone和GM－1进行神经保护值得临床推广应用。

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［11］Remirez M R，Muraro F，Zylbersztejn DS，et al.Neonatal hypoxia ischemia reduses ganglisoside，phospholipids and cholesterol contents in the rat hippocampus［J］.Neurosci Res，2003，46（3）：339.

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尹立国（1973－），男，主治医师，硕士研究生，主要从事颅脑创伤与脑血管病研究。

2013－11－19）

1007－4287（2014）10－1594－03