泸州引种金银花与山东金银花HPLC指纹图谱的比较

何兵 彭锋 田吉

摘要：采用ＨＰＬＣ法分析泸州引种金银花及山东金银花ＨＰＬＣ指纹图谱，评价泸州引种金银花质量。采用Ｋｒｏｍａｓｉｌ Ｃ１８色谱柱（２５０ ｍｍ×４．６ ｍｍ，５ μｍ），以乙腈和０．１％（Ｖ／Ｖ）磷酸水溶液梯度洗脱，柱温３０ ℃，流速１．０ ｍＬ／ｍｉｎ。结果表明，泸州引种金银花与山东金银花ＨＰＬＣ指纹图谱的相似度大于０．９７０，提示引种金银花与山东金银花质量相近，符合药典要求，建议推广栽培。

关键词：金银花；引种；指纹图谱；ＨＰＬＣ

中图分类号：Ｑ８１５文献标识码：Ａ文章编号：0439－８114（２０14）08－1905-04

Ｃｏｍｐａｒｉng ｔｈｅ Ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔｓ ｏｆ Fｌｏｗｅｒｓ ｏｆ Ｌｏｎｉｃｅｒａ ｊａｐｏｎｉｃａ Iｎｔｒｏｄｕｃｅｄ ｉｎ Ｌｕｚｈｏｕ ａｎｄ Oｒｉｇｉｎａｔｅｄ ｆｒｏｍ Ｓｈａｎｄｏｎｇ

ＨＥ Ｂｉｎｇ１， ＰＥＮＧ Ｆｅｎｇ２， ＴＩＡＮ Ｊｉ１

（１． Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｄｒｕｇ， Ｌｕｚｈｏｕ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｏｌｌｅｇｅ， Ｌｕｚｈｏｕ６４６０００， Ｓｉｃｈｕａｎ， Ｃｈｉｎａ；

２． Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ａｎｄ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ ｏｆ Ｌｕｚｈｏｕ， Ｌｕｚｈｏｕ ６４６０００， Ｓｉｃｈｕａｎ， Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ａ ＨＰＬＣ ｍｅｔｈｏｄ ｗａｓ used ｗｉｔｈ Ｋｒｏｍａｓｉｌ Ｃ１８（２５０ ｍｍ×４．６ ｍｍ，５ μｍ）ｔｏ ｓｔｕｄｙ ｔｈｅ ｓｉｍｉｌａｒｉｔｉｅｓ ａｎｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔ ｏｆ ｆｌｏｗｅｒｓ ｏｆ Ｌｏｎｉｃｅｒａ ｊａｐｏｎｉｃａ（ｈｏｎｅｙｓｕｃｋｌｅ） ｉｎｔｒｏｄｕｃｅｄ ｉｎ Ｌｕｚｈｏｕ ａｎｄ ｏｒｉｇｉｎａｔｅｄ ｆｒｏｍ Ｓｈａｎｄｏｎｇ ｔｏ ｅｖａｌｕａｔｅ ｔｈｅ ｑｕａｌｉｔｙ ｏｆ ｉｎｔｒｏｄｕｃｅｄ ｈｏｎｅｙｓｕｃｋｌｅ． Ｔｈｅ ｍｏｂｉｌｅ ｐｈａｓｅ ｗａｓ ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ ｗｉｔｈ ０．１％（Ｖ／Ｖ） ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｃ ａｃｉｄ ａｑｕｅｏｕｓ， ａｎｄ ｔｈｅ ｇｒａｄｉｅｎｔ ｅｌｕｔｉｏｎ ｐｒｏｇｒａｍ ｗａｓ ｓｅｌｅｃｔｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｆｌｏｗ ｒａｔｅ of １．０ ｍＬ／ｍｉｎ ａｔ ３０ ℃． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔｓ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｈｅ ｉｎｔｒｏｄｕｃｅｄ ａｎｄ ｔｈｅ ｏｒｉｇｉｎａｔｅｄ ｗａｓ ｈｉｇｈｅｒ ｔｈａｎ ０．９７０． Ｔｈｅ ｑｕａｌｉｔｙ ｏｆ ｈｏｎｅｙｓｕｃｋｌｅ ｉｎｔｒｏｄｕｃｅｄ ｉｎ Ｌｕｚｈｏｕ ｗａｓ ｓｉｍｉｌａｒ ｗｉｔｈ ｔｈｏｓｅ ｏｒｉｇｉｎａｔｅｄ ｆｒｏｍ Ｓｈａｎｄｏｎｇ， meeting ｔｈｅ ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ ｏｆ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｕｇｇｅｓｔｅｄ ｔｈａｔ ｉｔ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｐｌａｎｔed on large scale ｉｎ ｔｈｅ ｆｕｔｕｒｅ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｈｏｎｅｙｓｕｃｋｌｅ； ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ； ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔ； ＨＰＬＣ

金银花为忍冬科植物忍冬（Ｌｏｎｉｃｅｒａ ｊａｐｏｎｉｃａ Ｔｈｕｎｂ．）的干燥花蕾或带初开的花［１］，是常用清热解毒中药，也是家喻户晓的保健饮品。传统以山东、河南产金银花为优，常称为济银花，历来销量大、价格高［２］。四川也是金银花的主要产地，主栽品种包括忍冬科灰毡毛忍冬（Ｌｏｎｉｃｅｒａ ｍａｃｒａｎｔｈｏｉｄｅｓ Ｈａｎｄ-Ｍａｚｚ．）、细毡毛忍冬（Ｌｏｎｉｃｅｒａ ｓｉｍｉｌｉｓ Ｈｅｍｓｌ．）及红腺忍冬（Ｌｏｎｉｃｅｒａ ｈｙｐｏｇｌａｕｃａ Ｍｉｑ．）等［３］，通常称之为山银花，市场价格远远低于山东金银花。川南泸州为丘陵地带，比较适合金银花生长，本地栽培以灰毡毛忍冬为主。为提高本地金银花的质量、增加药农收入、推动地方经济发展，笔者从山东平邑引种了２ ０００株山东金银花，分别栽培于泸州市江阳区和泸县，并于第二年进行了扦插分株，经过３年的培育，将收获的干花与济银花比较，二者外观相近。为分析引种与原产地金银花的主要功能成分差异，采用ＨＰＬＣ法同时测定了４种主要活性成分（绿原酸、木犀草苷、异绿原酸Ａ和异绿原酸Ｃ）［４］的含量，二者基本一致；并通过对比分析指纹图谱考察了引种金银花的质量，为泸州地区推广种植山东金银花提供试验依据。

１材料与方法

１．１材料

山东金银花１０批（山东平邑县２０１２年７月采收），引种山东金银花１０批（泸州医学院药用植物园引种第３年，２０１２年７月采收）。药材均经作者鉴定为忍冬科忍冬的干燥花蕾。

绿原酸（批号０８０６２０）、木犀草苷（批号０９１０２６）、异绿原酸Ａ（批号０８０５３０）、异绿原酸Ｃ（批号０７１１１５）均由成都普瑞法有限公司提供（纯度＞９８％）。乙腈为色谱纯，其余试剂均为分析纯，水为去离子水。

１．２仪器

ＤＩＯＮＥＸ高效液相色谱仪（Ｐ６８０Ａ四元梯度泵，ＰＤＡ－１００二极管阵列检测器，ＴＣＣ－１００型柱温箱，Ｃｈｒｏｍｅｌｅｏｎ色谱工作站）；瑞士Ｐｒｅｃｉｓａ电子天平（ＸＲ ２０５ＳＭ－ＤＲ）；ＣＱＸ２５－０６型超声波清洗器（上海必能信超声有限公司，功率２５０ Ｗ，频率２５ ｋＨz）。

１．３方法

１．３．１色谱条件色谱柱：Ｋｒｏｍａｓｉｌ Ｃ１８（２５０ ｍｍ×４．６ ｍｍ，５ μｍ）；流动相：乙腈－０．１％（V/V）磷酸溶液，梯度洗脱：０ ｍｉｎ→２０ ｍｉｎ→２１ ｍｉｎ→２５ ｍｉｎ，乙腈１０％→３０％→１０％→１０％（Ｖ／Ｖ，下同）；流速：１．０ ｍＬ／ｍｉｎ；分段变波长测定：０～１２.0 ｍｉｎ为３２６ ｎｍ，１２.0～１６．５ ｍｉｎ为３５０ ｎｍ，１６．５～２５.0 ｍｉｎ为３２６ ｎｍ。柱温３０ ℃；进样量１０ μＬ。理论塔板数按绿原酸计不低于５ ０００。

１．３．２标准品溶液的制备称取各对照品适量于棕色容量瓶中，加７０％甲醇（Ｖ／Ｖ），摇匀，定容，配制得到不同浓度的标准品溶液。

１．３．３供试品溶液的制备称取金银花粉末约０．２ ｇ于带塞锥形瓶中，加入７０％甲醇２５ ｍＬ，称定重量，超声处理４５ ｍｉｎ，放冷，再称重，用７０％甲醇补足损失，摇匀，过滤，取续滤液，即得供试品溶液。

２结果与分析

２．１稳定性试验

取同一供试品溶液，分别于制备后０、４、８、１６、２４、４８ ｈ进样分析，记录色谱图。以绿原酸峰的保留时间和峰面积为参照，各共有峰的相对保留时间和７号色谱峰的峰面积比值基本一致，其ＲＳＤ均小于３．０％，相似度均在０．９９以上，符合指纹图谱的技术要求［３］，表明供试品溶液在４８ ｈ内稳定。

２．２精密度试验

取同一供试品溶液，连续进样６次，检测指纹图谱。以绿原酸峰的保留时间和峰面积为参照，各共有峰的相对保留时间及７号色谱峰的峰面积比值基本一致，其ＲＳＤ小于３．０％，相似度均在０．９９以上，符合指纹图谱的技术要求，表明仪器精密度良好。

２．３重复性试验

取同一批金银花样品６份，按“１．３．３”制备供试品溶液，分别检测指纹图谱。以绿原酸峰的保留时间和峰面积为参照，各共有峰的相对保留时间及７号色谱峰的峰面积比值基本一致，其ＲＳＤ均小于３．０％，相似度均在０．９９以上，符合指纹图谱的技术要求，表明本法重复性较好。

２．４指纹图谱的建立及共有指纹峰的标定

精密吸取绿原酸参照溶液、泸州引种金银花及山东金银花供试品溶液１０ μＬ，分别注入液相色谱仪。比较不同批次样品的色谱图，确定８个共有指纹峰，见图１和图２。分别吸取适当浓度的的新绿原酸、隐绿原酸、咖啡酸、木犀草苷、异绿原酸Ｂ、异绿原酸Ａ及异绿原酸Ｃ对照品溶液进样测定，并扫描对比其紫外可见光吸收光谱，同时在样品溶液中分别添加上述对照品溶液，鉴别相应色谱峰。结果表明，１号峰为新绿原酸，３号峰为隐绿原酸，４号峰为咖啡酸，５号峰为木犀草苷，６号峰为异绿原酸Ｂ，７号峰为异绿原酸Ａ，８号峰为异绿原酸Ｃ。

２．５共有指纹峰技术参数的确定

比较１０个批次金银花样品的色谱图，根据中药注射剂指纹图谱研究的技术要求［３］，以绿原酸峰作为参照峰（Ｓ峰），计算各共有指纹峰的保留时间、相对保留时间、峰面积、峰面积百分比、峰面积比值，见表１和表2。结果表明，各共有指纹峰的相对保留时间、峰面积比值相对固定，符合中药注射剂指纹图谱的技术要求。

２．６指纹图谱的相似度评价

根据《中药注射剂色谱指纹图谱实验研究技术指南（试行）》［４］，采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统２００４Ａ版》，对１０批泸州引种金银花和山东金银花药材的指纹图谱进行相似度分析，１０批山东金银花与对照指纹图谱相似度分别为：１．０００，０．９９９， ０．９９８，０．９９９，０．９９８，０．９９９，０．９９９，０．９９７，０．９９８，１．０００。若以１０批山东金银花平均值为对照指纹图谱，１０批泸州引种金银花与其相似度分别为：０．９９７，０．９８５，０．９７７，０．９９８，０．９９５，０．９８３，０．９９１，０．９７２，０．９６８，０．９８４。符合指纹图谱技术要求。１０批泸州引种金银花和山东金银花ＨＰＬＣ指纹图谱叠加图谱见图３和图４。

３小结与讨论

绿原酸、木犀草苷、异绿原酸Ａ及异绿原酸Ｃ色谱峰的最大吸收波长分别为： ３２６．４、３４８．３、３２７．７及３２７．５ ｎｍ。采用分段变波长法测定，根据各成分保留时间差异，分别设定检测波长：在０～１２.0 ｍｉｎ为３２６ ｎｍ， １２.0～１６．５ ｍｉｎ为３４８ ｎｍ，１６．５～２５.0 ｍｉｎ为３２８ ｎｍ，可使各色谱峰获得最大丰度，可有效提高分析方法的灵敏度。

文献［５－１０］建立金银花指纹图谱普遍采用乙腈-０．４％（V/V，下同）磷酸溶液，但其梯度条件不合适，分离时间普遍在４０ ｍｉｎ以上，且由于０．４％磷酸溶液ｐＨ偏低，对色谱柱有一定伤害。试验采用０．１％磷酸水溶液和乙腈，梯度洗脱，２０ ｍｉｎ内分离完主要色谱峰，分离度、拖尾因子、理论板数均符合要求。在适用性方面，分别采用不同厂家的液相色谱仪（Ｄｉｏｎｅｘ Ｐ６８０、Ｗａｔｅｒｓ ２６９５）和不同品牌的色谱柱（Ｋｒｏｍａｓｉｌ Ｃ１８，Ｓｐｕｒｓｉｌ Ｃ１８，Ｌｕｎａ Ｃ１８）测定，均能获得较好的色谱结果，各色谱峰均能达到分离度要求，表明本方法适用性良好。

对比引种的１０批金银花和山东金银花指纹图谱对比可见，虽然各个色谱图的小峰有一定差异，但均检测出主要的８个化学成分，且泸州引种金银花与山东金银花ＨＰＬＣ指纹图谱相似度均在０．９７０以上，相似度较高，表明二类样品的整体质量相近。与前期测得的二者主要化学成分含量基本一致，说明泸州引种山东金银花质量达到药典要求，可作药用，表明泸州地区具有进一步推广引种山东金银花的可行性。

参考文献：

［１］ 国家药典委员会．中华人民共和国药典（一部）［Ｍ］．北京：中国医药科技出版社，２０１０．

［２］ 冯文宇，田吉，何兵．济银花与川银花绿原酸含量及提取率实验研究［Ｊ］．中药材，２００６，２９（１）：３０－３１．

［３］ 苟占平．川产金银花的品种品质研究［Ｄ］．成都：成都中医药大学，２００４．

［４］ 于生兰，张龙，孙玲．金银花的研究进展［Ｊ］．时珍国医国药，２００２，１３（８）：４９８－５００．

［５］ 杨雪萍，袁红英，李峰．不同产地金银花药材高效液相指纹图谱的研究［Ｊ］．江西中医学院学报，２００９，２１（４）：３８－４０．

［６］ 王跃飞，文红梅，程建明．金银花药材ＨＰＬＣ指纹图谱研究［Ｊ］．南京中医药大学学报，２００６，２２（２）：１２８－１２９．

［７］ 郑霞，刘军，杨永波，等．金银花药材指纹图谱的建立［Ｊ］．黑龙江中医药，２００８，４（６）：４２－４３．

［８］ 熊艳，高慧敏，王智民，等．金银花不同干燥技术ＨＰＬＣ指纹图谱研究［Ｊ］．中国中药杂志，２００９，３４（８）：１０１５－１０１７．

［９］ 李文，易进海，刘芳，等．金银花饮片和金银花现代饮片ＲＰ－ＨＰＬＣ指纹图谱对比研究［Ｊ］．成都大学学报（自然科学版），２０１２，３１（１）：２１－２４．

［１０］ 陈君，彭锋，王河川，等．泸州山银花及其提取物高效液相色谱指纹图谱研究［Ｊ］．时珍国医国药，２００８，１９（１０）：２３６７－２３６９．