几种SDS睵AGE凝胶电泳染色方法的比较

林方养　杨耀东　万婕等

摘要

[目的]对几种SDSPAGE凝胶电泳染色方法进行比较。[方法]从凝胶背景颜色、染色时间及灵敏度的角度对6种SDSPAGE凝胶电泳快速染脱色方法进行比较研究，并对适用于椰子和油棕总蛋白质SDSPAGE凝胶电泳的实用方法进行总结。[结果]方法F最快速，条带清晰，染料及试剂都较少，是一种经济、快速、安全、实用的染色方法，整个过程仅需1 h左右。[结论]试验比较了几种SDSPAGE凝胶电泳染色方法，对进一步开展椰子和油棕蛋白质组学研究具有重要意義。

关键词 SDSPAGE凝胶电泳；染色方法；比较

中图分类号 S188 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2014）08-02295-02

Comparison of Several SDSPAGE Gel Electrophoresis Staining Methods

LIN Fangyang， WU Yi et al

（Coconut Research Institute of Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences/Hainan Provincial Key Laboratory of Tropical Oil Crops Biology， Wenchang， Hainan 571339）

Abstract [Objective] To compare several SDSPAGE gel electrophoresis staining methods. [Method] From perspective of gel background color， staining time and sensitivity， six SDSPAGE gel electrophoresis staining and destaining methods were compared， a suitable practical method of total protein SDSPAGE gel electrophoresis for coconut and oil palm was summarized. [Result] Method F is the fastest with clear band， less dyes and kit， which is an economy， rapid， safety， practical staining method. [Conclusion] The study has significance on further research of coconut and oil palm proteomics.

Key words SDSPAGE gel electrophoresis； Staining methods； Comparison

SDSPAGE（即十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺）凝胶电泳是对蛋白质进行量化、比较及特性鉴定的常用方法，具有经济、快速和可重复等特点，可依据蛋白质的分子量对其进行分离技术。该技术在蛋白质分析中，具有设备简单、操作方便、所需的样品少和分辨率高等优点，在分析或研究中应用范围广泛，可用于蛋白质、酶、核酸等生物大分子的分离、定性、定量及少量的制备，还可用于测定分子量、等电点等[1]。

目前，对蛋白质进行电泳染色分析的方法有许多种，如：程冬梅等的氯化钙和氯化镁溶液能够对蛋白质进行有效的染色[2]；许文涛等的氯化钾染色方法[3]；常胜合等的考马斯亮蓝染色、银染、荧光染色和负染方法[4]。在实际运用中，运用较多的是银染和考马斯亮蓝染色法。银染法是目前蛋白质凝胶电泳中最敏感的方法之一，但硝酸银具有腐蚀性，并对环境造成一定的污染，且对技术要求较高。考马斯亮蓝染色法操作简便，污染性较低，染色效果较好，近年来应用较为广泛[5-7]。笔者以考马斯亮蓝G250为染料，通过同一条件处理的蛋白质凝胶进行不同方法的染色，试图找出一种经济、节时、高效的快速染色方法，以期为今后深入开展蛋白质组学研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

以椰子和油棕的嫩叶片作为蛋白质提取材料，叶片采自中国热带农业科学院椰子研究所试验基地。

1.2 方法

1.2.1

蛋白质的提取。参考王旭初的方法[8]。

1.2.2

6种染色及脱色方法。①A方法。参考汪家政的方法[9]。电泳后先将凝胶用蒸馏水（约100 ml）洗1～2遍，加100 ml的染色液染色6 h或过夜，蒸馏水（约100 ml）洗1次，加100 ml脱色液脱色30 min，2次，移至保存液保存。②B方法。参考王旭初的方法[8]。操作方法同A（染色液和脱色液不同）。③C方法。参考于保峰等人的方法[10]。电泳后先将凝胶浸入100 ml蒸馏水中，微波炉内强火加热约3 min（刚好沸腾停止），待稍冷却后再重复1次，然后将凝胶浸入100 ml染色液中，微波炉中加热3 min，振荡30 min，完成染色过程；脱色时，蒸馏水洗去多余的染色液，将凝胶浸入100 ml蒸馏水中，微波炉内强火加热3 min，重复2～3次，冷却后即完成脱色过程，放入蒸馏水中保存。④D方法。参考G. Hervieu的方法[11]。用100 ml的蒸馏水洗凝胶1～2次，将100 ml染色液置微波炉高火2～3 min（刚好沸腾停止），振荡30 min；倒掉染色液水洗1次，加100 ml脱色液置微波炉高火2～3 min（刚好沸腾停止），振荡30 min，重复1次；将脱色好的凝胶置保存液中保存。⑤E方法。参考J. E.科林根等人的方法[12]。从电泳仪中取出聚丙烯酰胺凝胶，用100 ml的蒸馏水洗凝胶1～2次，放入塑料或玻璃容器中，容器内含有100 ml凝胶的异丙醇固定液，1.5 mm厚的凝胶则摇动60 min；弃去固定液，加100 ml快速考马斯亮蓝G250染色液，1.5 mm的凝胶则摇动3 h；弃去染色液，加100 ml浓度10%乙酸洗脱液洗脱2次，直到清晰的背景上能看见清楚的蛋白条带。⑥F方法。参考查德 J的方法[13]。电泳结束后，用100 ml的蒸馏水洗凝胶1～2次，将凝胶置于盛有100 ml试剂a的微波炉专用塑料容器中；用微波炉的强火加热凝胶剂试剂a直到溶液沸腾，约2～3 min；室温摇床上摇动凝胶30 min，弃去用过的试剂a，用水快速地冲洗一下凝胶，这时，即使在蓝色的背景下也可以看到蛋白质含量在100 ng以上的蛋白条带显现出来；加入100 ml试剂b，用微波炉的高火加热凝胶直至溶液沸腾；弃去热试剂b，用蒸馏水冲洗凝胶，此步完成后可见蛋白含量在50 ng以上的条带；加入100 ml试剂c，并用微波炉高火加热凝胶至沸腾；弃去加热试剂c，用蒸馏水漂洗凝胶，这样，蛋白含量在25 ng以上的蛋白条带可显现；加热100 ml试剂d，并用微波炉高火加热凝胶至沸腾；在溶液中放入纸巾，吸取多余染料；室温冷却凝胶5 min，此时蛋白含量大于5 ng的条带也能显现；重复步骤“加热100 ml试剂d”后面操作2次以上，或将凝胶放在试剂d中于室温摇动15 min以上，这时某些仅含有2.5 ng的蛋白条带也能显现。

2 几种方法的比较分析

图1表明，方法A的条带也比较清晰，但凝胶背景较深，较难脱色。方法B的效果很好，唯一的缺陷就是所需的时间较长，大概需要7～8 h才能完成分析过程。方法C试剂只有蒸馏水加染料，其他试剂完全省去，条带也可以显现，但效果不够清晰。方法D采用的是微波快速染色脱色的方法，较A～C法速度快，但条带不够清晰。方法E所用的染料是所有的方法中最少的（200 ml中仅有0.012 g的考马斯亮蓝G250），但此方法需要固定后才能染色，整个过程需要5～6 h，效果和F法区别不大。方法F最快速，条带清晰，染料及试剂都较少，是一种经济、快速、安全、实用的染色方法，整个过程仅需1 h左右。

3 结论

综上所述，通过几种SDSPAGE凝胶电泳染色方法的比较，围绕染色方法的优化，集中在以下几个方面：提高染色灵敏度；簡化操作过程；减少试剂及染料的用量；朝着低毒的方向发展。上述的几种方法中，F法较其他的方法快速，灵敏度较高，所以试剂及染料少，但F法中使用了异丙醇，其是一种有毒物质，叶长春[14]在文章中用无水乙醇来代替无水甲醇进行染色优化，取得了较好的效果。今后对于F法的研究，将尝试用无水乙醇来代替异丙醇进行优化。试验中，F法是以上6种染色方法中效果较好的一种凝胶染色方法，值得在实验室推广和运用。

参考文献

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[3] 许文涛，黄昆仑，常世敏，等. SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳快速脱色方法的比较研究[J].食品科学，2004，25（S1）：148-151.

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[5] 李慧，吴恩应，张运佳.低毒高效的SDSPAGE考马斯亮蓝染色方法比较[J].生物技术通讯，2011，22（2）：261-263.

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[11] HERVIEU G.MRC Molecular Neuroscience Group， Department of Neurobiology[M].Cambridge， UK：Babraham Institute，1997.

[12] J·E·科林根. 精编蛋白质科学实验指南[M].北京：科学出版社，2007：316-317.

[13] 理查德，辛普森.蛋白质与蛋白质组学实验指南[M].北京：化学工业出版社，2006：60-61.

[14] 叶长春. SDS一聚丙烯酰胺凝胶电泳染色方法的改进[J].湖北工业大学学报，2009，29（4）：16-18.