苯巴比妥分子印迹体系模拟与吸附性能研究

苏婷婷，刘俊渤∗，唐珊珊，靳瑞发

（1.吉林农业大学资源与环境学院，长春130118；2.内蒙古赤峰学院化学化工学院，赤峰024000）

分子印迹技术是指以目标分子为印迹分子，制备对该分子具有特异识别性分子印迹聚合物（MolecularImprinted Polymers，MIPs）的过程。 MIPs制备主要依靠印迹分子与功能单体之间的相互作用，因此，印迹分子与单体的反应比例将决定着MIPs的识别性能。目前，MIPs制备中功能单体与印迹分子的反应比例主要是通过核磁共振光谱法、紫外分光光度法或比较不同反应比例MIPs的吸附量［1－3］进行确定。 为提高 MIPs的合成效率，越来越多研究者以计算机模拟取代实验［4－6］，为优化分子印迹体系提供了理论依据。

苯巴比妥（PHN）由于可促进动物生长而被滥用为动物饲料添加剂，有致癌致畸等副作用［7］。PHN常用的检测方法需要通过预处理把其从混合样品中分离出来。MIPs特异吸附性强，是较好的选择性吸附材料，在很多领域得到广泛应用［8－9］。目前，利用MIPs印迹识别PHN研究主要采用了两步溶胀法，合成的 MIPs粒径处在微米级［10－11］。 相比之下，纳米级的MIPs具有比表面积大、吸附容量高及选择性能好等优点［12］。本文借助量子化学理论优化了PHN印迹分子与甲基丙烯酸（MAA）单体的反应比例，在最佳比例下采用沉淀聚合法合成了纳米级苯巴比妥分子印迹聚合物（PHN－MIPs），并对其吸附性能进行了研究。

1 实验部分

1.1 理论计算方法 PHN与功能单体间主要通过氢键进行印迹聚合反应，而杂化密度泛函M062X在氢键计算方面优于其它密度泛函［13］。因此，本文借助于 Gaussian 09程序 Revision A.02版软件［14］，在 M062X 理论及三种基组（6－31g （d，p）、6－31g＋＋（d，p）、6－31g＋＋＋（d，p））下进行 PHN（图1A）结构优化计算，结果列于表1。表1数据表明，M062X理论下三种基组间键长与键角的差值分别在 0.0001～0.0010 与 0～0.3 范围，这说明基组大小没有明显引起分子结构变化。同时，M062X理论下PHN分子结构理论数据与实验值［15］接近，键长与键角差值分别在 0.0001～0.0016 与 0～1.6 间，均在允许误差范围之内，证明了M062X方法的可行性。因此，本研究选取 M062X／6－31g （d，p）方法优化PHN、MAA（图1B）及其复合物的几何构型。

图1 PHN（A）与 MAA（B）分子结构

表1 密度泛函理论M062X水平下的PHN结构参数与实验值

1.2 实验试剂与仪器 苯巴比妥（PHN）：标准品，中国药品生物制品检定所；甲基丙烯酸（MAA）：分析纯，天津化学有限公司；乙二醇二甲基丙烯酸酯（EGMA）：分析纯，上海晶纯试剂有限公司；偶氮二异丁腈（AIBN）：分析纯，天津光复精细化工研究所；乙腈、甲醇与乙酸：分析纯，北京化工厂。

SHZ－88水浴恒温振荡器：金坛市开发区吉特实验仪器厂；JSM－5600扫描电子显微镜：日本JEOL电子株式会社；TU－1901双光束紫外分光光度计：北京普析通用仪器有限公司；DZF－6062真空干燥箱：上海－恒科仪器有限公司；Spectrum 100傅里叶红外光谱仪：上海珀金埃尔默仪器有限公司。

1.3 分子印迹聚合物的制备 将 0.0232 g（0.1 mmol））PHN、0.0516 g（0.6 mmol）MAA 溶于40 mL乙腈中，超声溶解后于室温放置24 h，加入0.5943 g（3.0 mmol）EGMA 和 0.020 gAIBN，超声0.5 h后除氧密封，60℃恒温水浴中反应24 h后得到沉淀聚合物；用体积比为8∶2的甲醇－乙酸混合溶液洗脱聚合物中的 PHN，蒸干至恒重，得到PHN－MIPs。在不加印迹分子的前提下合成NIPs，步骤同上。

采用JSM－5600扫描电镜观测聚合物微球的大小及形貌。同时采用Spectrum 100红外光谱仪对制备的聚合物进行红外光谱扫描。

1.4 静态与动态吸附试验 静态吸附试验：称取0.020 g 的 PHN－MIPs（NIPs）于三角瓶中，分别加入 10 mL 不 同 浓 度 （0 、10、20、40、60、80、100 mg／L）的 PHN甲醇溶液，超声混匀后置于28℃恒温水浴振荡器中进行24 h的印迹吸附。吸附后离心分离，取上层清液用0.22 μm的滤头过滤，滤液通过紫外分光光度计测定其吸光度，根据结合前后浓度的变化计算聚合物对目标分子的结合量 Q。Q ＝ （C0－ C）V／W

其中Q为印迹聚合物对PHN的吸附量（mg／g），C0、C分别为PHN的初始浓度和吸附后的浓度（mg／L），V 为吸附溶剂的体积（mL），W 为聚合物微球的质量（mg）。

动态吸附试验：称取 0.020 g的 PHN－MIPs（NIPs），置于已知浓度PHN甲醇溶液中，测定不同时间段内PHN甲醇溶液的吸光度，根据结合前后浓度的变化计算聚合物对目标分子的结合量Q。

2 结果与讨论

2.1 PHN与MAA几何结构分析 在密度泛函理论 M062X／6－31g（d，p）下优化 PHN 与 MAA 分子结构，并分析其最高占据分子轨道（HOMO）与最低未占据分子轨道（LUMO），结果见图2。前线轨道可以判断分子的化学反应活性与稳定性。其中，最高占据轨道能量EHOMO反应给电子能力，能量越高，给电子能力越强；反之，最低未占据轨道能量ELUMO越低，接受电子能力越强。由图2可知，PHN的最高占据轨道能量EHOMO＝－8.417 eV，其主要位于苯环及嘧啶环上的C＝O上，是PHN的主要电子供体部分。最低未占据轨道能量ELUMO＝－0.342 eV，其主要位于嘧啶环上的内酰胺基团部分，是PHN的主要电子受体部分。同理，图 2B中 MAA中－COOH基团占据大部分的 HOMO轨道成分，而LUMO包含较多的－CH＝CH－轨道成分，还包含－COOH基团，说明MAA的－COOH基团既可以作为电子给体，又可作为电子受体。由于PHN的EHOMO为 －8.417 eV，高于 MAA 的 EHOMO（－8.940 eV），所以在形成氢键时PHN更容易给出电子，显示出较高的反应活性。

2.2 PHN与MAA复合物构型优化 印迹分子与功能单体处于合适反应比例时，单体与印迹分子间产生较强相互作用，这种相互作用使得MIPs具有较高的印迹识别性能。因此，选取合适的印迹分子－单体反应比例直接决定MIPs的稳定性与选择性。借助于 Gaussian 09软件，利用自洽反应场中的Tomasi极化连续模型模拟PHN印迹分子与MAA单体在60℃乙腈溶剂中相互作用过程。以相互作用位点数目越多，复合物越稳定为原则，对复合物进行比较，选取相互作用位点最多的印迹分子－单体复合物作为研究对象。PHN与MAA在不同反应比例下的复合物构型及其氢键键合数据见图3。由图3可知，PHN结构中反应位点为 H7、H8、N14、N15、O16、O17、O18，MAA 反应位点为－COOH 基团上的羰基氧原子与羟基氢原子。其中，MAA的C＝O作为电子供体与PHN电子受体N－H氢键键合，MAA的O－H作为电子受体与PHN电子供体C＝O氢键键合。如反应比例为1∶6的复合物（图3F），PHN的O16作为电子供体与MAA的电子受体H65、H89形成两个氢键。PHN的H7作为电子受体与MAA的电子供体O51形成一个氢键。该结果与上述HOMO、LUMO结论一致。

从表2可以看到，随PHN与MAA功能单体反应比例的增加，分子间氢键相互作用位点数目也增加，即反应比例为1 ∶1、1 ∶2、1 ∶3、1 ∶4、1 ∶5、1 ∶6时，PHN与MAA复合物的氢键作用位点数目分别为 2、4、5、6、7、8。 这说明印迹分子－单体复合物随反应比例增加，氢键相互作用越强，稳定性越好。当反应比例增加至1∶7时，功能单体间相互作用，阻碍了印迹分子与功能单体间的氢键相互作用，最终导致反应比例为1∶7的复合物氢键作用位点数目低于1∶6，稳定性也随之降低。因此，反应比例为1∶6的印迹分子－单体复合物稳定性最好，其作用位点及氢键键长分别为：O39┅H8—N15（0.1742 nm）、O40—H41┅O17（0.1787 nm）、O51┅H7—N14（0.1741 nm）、O52—H53┅O18（0.1806 nm）、O64—H65┅O16（0.2136 nm）、O76—H77┅O18（0.1813 nm）、 O88—H89 ┅ O16 （0.1866 nm）、O100—H101┅O17（0.1802 nm），有望制备对 PHN更高稳定性、选择性及吸附性的MIPs。

图2 PHN（A）与MAA（B）的前线分子轨道分布图

图3 PHN与MAA在不同反应比例下的复合物模型

表2 PHN与MAA在不同反应比例下的氢键键合数据

2.3 不同反应比例 PHN－MIPs（NIPs）的吸附性在上述模拟计算指导下，制备PHN与MAA在反应比例为 1 ∶1、1 ∶4、1 ∶5、1 ∶6、1 ∶7的 PHN－MIPs与NIPs，并测定其吸附性能（图4）。PHN甲醇溶液的初始浓度为100 mg／L。由图4可知，随PHN与MAA反应比例的增加，聚合物的吸附量也增大。当反应比例增加至1∶7时，PHN－MIPs的吸附量略有降低。因此，制备PHN－MIPs的最佳反应比例为1∶6。该研究还表明，吸附实验与上述计算模拟结果一致。此外，所有比例下的PHN－MIPs的吸附能力明显高于 NIPs，原因在于印迹分子参与了PHN－MIPs的合成，使得洗脱后的PHN－MIPs存在一个与印迹分子相匹配的“孔穴”，该孔穴结构对PHN存在特异吸附能力，而NIPs只能进行表面吸附。

图4 不同反应比例下PHN－MIPs与NIPs的吸附量

2.4 扫描电镜表征 对以MAA为功能单体的PHN－MIPs和 NIPs进行扫描电子显微镜表征（图5）。由图5可知乙腈溶剂中制备的PHN－MIPs（图5A）与NIPs（图5B）呈微球状态，粒径均一，且分散性良好。借助Nano Measurer 1.2软件对聚合物微球进行粒径分布分析，结果如图6。图中粒径分布结果表明 PHN－MIPs与 NIPs粒径分别在180～360 nm（平均粒径为 253 nm）与 140～310 nm（平均粒径为 208 nm）范围内，优于文献［10］与［11］中通过两步溶胀法合成的MIPs效果，且相比于NIPs，PHN－MIPs有更好的吸附容量。

图5 PHN－MIPs（A）与 NIPs（B）的扫描电镜图

图6 PHN－MIPs（A）与 NIPs（B）的粒径分布图

2.5 MIPs与NIPs的吸附性能研究 称取相同量的PHN－MIPs或NIPs置入10 mL不同浓度的PHN甲醇溶液中，测定28℃下聚合物微球对PHN的吸附量，结果如图7（A）。由图7（A）可知相同温度下PHN－MIPs与NIPs吸附量随PHN初始浓度的增加而增加，当 PHN初始浓度达 120 mg／L时，PHN－MIPs与NIPs均达到最大饱和吸附量。此外，PHN－MIPs饱和吸附量为 8.2 mg／g，明显高于 NIPs的最大饱和吸附量（3.5 mg／g），表现出很好的特异吸附性。

固定 PHN初始浓度，测定不同时间段内PHN－MIPs与NIPs的吸附量，并绘制PHN－MIPs与NIPs的吸附动力学曲线，结果如图7（B）。图中PHN－MIPs与NIPs吸附量随时间的增加而增加，吸附一定时间后达到平衡。此吸附过程分迅速吸附与缓慢吸附两个阶段。在初始阶段，PHN－MIPs具有较多的吸附位点，吸附速率达60%；150 min后，PHN－MIPs对PHN的吸附进入缓慢吸附阶段，吸附速率达30%；300 min后，PHN－MIPs上所有吸附位点均被占据，此时吸附量达到最高。因此，利用分子印迹聚合物检测PHN药物残留量的时间不得低于300 min。此外，与 PHN－MIPs相比，NIPs吸附速率仅达45%，且吸附平衡时间提前于240 min。

图7 PHN－MIPs（NIPs）的吸附等温线（A）与吸附动力学曲线（B）

2.6 红外光谱分析 红外光谱可反映PHN－MIPs的结构信息，当功能单体MAA质子受体C＝O或质子给体O－H与印迹分子PHN质子给体或质子受体形成氢键时，使其特征吸收振动峰移向较低频率。图8为PHN－MIPs、NIPs的红外光谱图，从图中可以看出，PHN－MIPs和NIPs的红外光谱相近，但单体MAA特征官能团C＝O、O－H振动峰的位置、强度与宽度有明显差别。MAA单体未形成氢键时 C＝O振动吸收峰在 1770 cm－1处，而形成PHN－MIPs后，上述振动吸收峰移至 1732 cm－1处，这是因MAA分子中C＝O与PHN的质子给体N－H形成氢键所致，见图3。图中还可看到，NIPs在3026 cm－1处有O－H的弯曲振动吸收峰，而MIPs共聚物中O－H吸收峰在2989 cm－1，其吸收峰不仅增强，且谱带向低频率方向红移了37 cm－1，这表明单体MAA分子中的质子给体O－H与PHN印迹分子的质子受体C＝O可形成较强的氢键。

图8 PHN－MIPs与NIPs的红外光谱图

3 小 结

以PHN为印迹分子，MAA为功能单体，采用量子化学模拟计算研究60℃乙腈中PHN印迹分子与MAA功能单体不同反应比例时形成复合物的构型、成键情况及印迹原理，阐明了PHN－MIPs印迹本质及其印迹作用机理，优化了印迹分子与单体反应比例。按最佳反应比例1∶6，采用沉淀聚合法制备的 PHN－MIPs呈微球形状，粒径在 180～360 nm范围，20 mg PHN－MIPs的最大饱和吸附量为8.2 mg／g。 本研究为 PHN－MIPs的选择性分离、富集和检测样品中的PHN提供了理论与实验参考依据。

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