无患子SRAP-PCR反应体系的优化

彭珠清，范辉华，刘 宝，刘 燕，李 静

（1.福建农林大学 林学院，福建 福州 350002；2.福建林业科学研究院，福建 福州 350012）

无患子Sapindus mukurossi属于无患子科Sapindaceae无患子属Sapindus，是一种非常有潜力的经济树种，其果可以用来制作洗涤剂，种仁能提取生物柴油，树形美观，可用于园林观赏等。日本、法国、中国台湾等对其蕴含的经济价值有一定的开发利用，而中国大陆虽早在几百年前就已对其有初步利用，但深度开发这方面却尚在起步阶段[1-3]。目前，对无患子的研究主要集中在生物学特性、繁殖技术[1,4]、化学成分和分离提取技术及其利用价值的开发研究[5－7]等方面，而在分子生物学方面的研究报道不多[8-9]。分子标记技术是研究种质资源遗传背景的重要手段，2001年美国加州大学蔬菜作物系Li与Quiros博士提出了一种新型的基于聚合酶链式反应（PCR）的标记方法的相关序列扩增多态性（sequence-related ampli-fied polymorphism，SRAP）标记方法[8，10]。该标记通过独特的双引物设计对基因 的 ORFs（open reading frames）的特定区域进行扩增。与其他分子标记相比，该方法具有简单高效、多态性高、重复性较好等特点，并已成功应用于多种蔬菜、经济树种的种质资源分析中[5-7,11-13]。但在无患子的遗传多样性以及种质鉴定等方面还鲜见报道。为此，本研究以无患子叶片为材料，采用单因素优化的方法建立无患子SRAPPCR的最佳反应体系，旨在为不同地理种源无患子的遗传多样性分析、亲缘关系鉴定、遗传图谱构建、遗传改良等奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料来源

试验材料采于福建顺昌无患子种源收集区，共12个种源地36份种质材料。本优化试验以福建南平种源地的基因组DNA为试验材料。

1.2 主要试剂

试验中所用的三磷酸碱基脱氧核苷酸（dNTP）s，TaqDNA酶，琼脂糖和DNA标记物均购自上海生工生物工程有限公司，其中100 bp标记物是加DNA梯度。所用的SRAP引物序列由上海生物工程（上海）股份有限公司合成，其序列参照 Li等[10]和 Ren 等[14]的方法。

优化试验引物选用me2-em7组合，体系验证引物选用me2-em7和me6-em1，序列具体如表1。

1.3 无患子总DNA的提取

无患子总DNA提取采用改良的十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）法[15-16]。DNA 的浓度和纯度，分别用质量浓度为1%的琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计分析检测。样品稀释至 10 μg·L－1后，置－20 ℃冰箱保存备用。

1.4 反应体系的优化

SRAP-PCR基本反应体系：在20.0 μL总体积中，含 2.0 μL 10×PCR 缓冲液（free Mg2+），2.0 mmol·L－1镁离子（Mg2+），0.2 mmol·L－1dNTPs，2.0×16.67 nkat（2.0 U） TaqDNA 聚合酶，正反引物各 0.5 μmol·L－1，用双蒸水补足至20 μL。

SRAP-PCR扩增程序为：94℃预变性3 min；94℃变性l min，35℃复性l min，72℃延伸l min；共5个循环。随后94℃变性l min，50℃复性1min，72℃延伸l min，共35个循环；最后72℃延伸10 min。PCR仪为ABI梯度PCR仪。

本试验采用单因素法对反应体系进行优化，分别调整模板DNA，镁离子，dNTPs，引物，TaqDNA聚合酶各因子的用量（表2）。

表2 反应体系各因子水平Table2 Reaction system in each factor level

1.5 PCR产物的检测

将PCR产物与上样缓冲液（5：1）混合后于质量分数为1.5%琼脂糖凝胶上电泳，用溴化乙锭（EB）染色后，在凝胶成像系统（AlphaImager HP）上观察。

2 结果与分析

2.1 无患子基因组DNA检测

无患子叶片内富含多酚、多糖、蛋白质及其他次生代谢物质[14]，操作时易发生褐变，干扰DNA的提取，这些物质若残留在DNA样品中将会严重影响PCR的效果，导致DNA的酶切、扩增失败，对后续试验研究的开展有很大的影响。本研究采用改良的CTAB法，成功提取出质量较高的基因组DNA，条带较为清晰、完整、无拖尾，符合SRAP分子标记对DNA质量的要求（图1）。

图1 不同无患子总DNA电泳检测图Figure1 Electrophoresis of total genomic DNA from 12 different Sapindus mukurossi provenances

经紫外分光光度计测定，其D260/D280为1.2～2.2（表3），经纯化均能达到1.8左右的比值。所有样品质量浓度均大于430 μg·L－1，在SRAP分析中可获得较为清晰、稳定的扩增结果产物。

表3 无患子总DNA浓度检测Table3 Concentration detection of total genomic DNA from 12 different Sapindus mukurossi provenances

2.2 模板DNA对PCR扩增的影响

本试验设定了10个用量梯度（10～100 ng），研究不同模板DNA用量对PCR扩增的影响。模板DNA使用量在设定范围内，都能扩增出几乎相同的清晰条带（图2）。10 ng时条带比较模糊；70～100 ng时，条带较淡、呈波浪状，20～60 ng时主带比较清晰。DNA较长时间保存会部分降解，致使有效含量降低。考虑到试验时间较长，为避免DNA降解对试验结果的影响，最终选择50 ng作为模板优化用量。

2.3 镁离子浓度对PCR扩增的影响

镁离子浓度对PCR扩增影响较大。镁离子浓度过高时，TaqDNA聚合酶催化非特异性扩增，降低反应的忠实性；反之，镁离子浓度过低时，则又会使TaqDNA聚合酶的活性下降，反应产物减少。当镁离子浓度为 1.00 mmol·L－1时，未扩增出条带；当 Mg2+浓度为 1.25～1.75 mmol·L－1时，条带模糊，出现缺失现象；当镁离子浓度为2.00～2.50 mmol·L－1时，扩增带型基本一致；当镁离子浓度增至2.75，3.00 mmol·L－1时，条带呈弥散趋势（图3）。高浓度镁离子易产生非特异性产物，为避免高浓度镁离子对后续试验的影响。本研究最终选择2.00 mmol·L－1作为镁离子的优化浓度。

图2 模板DNA用量对PCR扩增的影Figure2 Effect of DNA template concentration on PCR amplification

图3 镁离子浓度对PCR扩增的影响Figure3 Effect of Mg2+concentration on PCR amplification

2.4 dNTPs浓度对PCR扩增的影响

dNTPs对SRAP-PCR反应有极其重要的作用，dNTPs浓度过高会增加DNA聚合酶的错配率，而浓度过低又会降低产量。dNTPs浓度为 0.05～0.15 mmol·L－1时，条带较少且模糊，0.20～0.25 mmol·L－1时条带较为清晰，在0.30～0.45 mmol·L－1时条带又开始模糊，最终确定0.20 mmol·L－1为dNTPs的优化浓度（图 4）。

2.5 TaqDNA聚合酶用量对PCR扩增的影响

TaqDNA聚合酶的用量与反应体积、酶活性等因素有关。一般酶用量过多会使非特异性增加、弥散背景增强，用量过少则会降低产量，使条带不够明亮。当TaqDNA聚合酶用量为0.5×16.67 nkat（0.5 U）和1.0×16.67 nkat（1.0 U）时，条带均较多，但0.5×16.67 nkat（0.5 U）时，条带亮度更佳；当TaqDNA聚合酶用量（0.6～0.9）×16.67 nkat（0.6～0.9 U）时，条带较少；当 TaqDNA 聚合酶用量为（1.2～2.0）×16.67 nkat（1.2～2.0 U）时，条带少（图 5）。综上，当 TaqDNA 聚合酶用量为 0.5×16.67 nkat（0.5 U）时，扩增效果最理想，以此作为TaqDNA聚合酶的优化用量。

图4 dNTPs浓度对PC R扩增的影响Figure4 Effect of dNTPs concentration on PCR amplification

图5 TaqDNA用量对PCR扩增的影响Figure5 Effect of TaqDNA concentration on PCR amplification

2.6 引物浓度对PCR扩增的影响

引物过多会产生引物二聚体，引物过低则降低产量。在设定的引物浓度范围内，PCR产物量基本相同（图 6）。当引物浓度为 0.2～0.4 μmol·L－1有较清晰、 一致的条带，且 0.4 μmol·L－1时，条带较亮；当引物浓度为 0.5～1.0 μmol·L－1开始条带渐变弱，扩增效果不佳，均较模糊。综上，选择 0.4 μmol·L－1作为引物的优化浓度。

2.7 SRAP-PCR反应体系的确立

本研究用引物组合m2e7和m6e1在无患子材料中进行SRAP-PCR优化反应体系验证，扩增结果比较稳定、条带清晰（图7），且引物组合m6e1扩增出的多态性条带较引物组合m2e7多，表现出更高的多态性。由此说明，该体系适宜无患子SRAP-PCR反应。

通过对反应体系的验证，从结果的稳定性和经济性出发，确立了适合无患子的SRAP-PCR反应体系为：在20 μL反应体系中，含模板DNA为50 ng，镁离子 2.0 mmol·L－1，dNTPs 0.2 mmol·L－1，TaqDNA聚合酶 0.5×16.67 nkat（0.5 U）,引物 0.4 μmol·L－1。

图6 引物浓度对PCR扩增的影响Figure6 Effect of primers concentration on PCR amplification

图7 优化体系验证图（左m2e7，右m6e1）Figure7 Optimized system verification（left m2e7，right m6e1）

3 讨论

SRAP标记是一种基于PCR的新型分子标记技术，具有以下优点：①有一套通用引物，可任意搭配，通过筛选获取适合引物对，极大降低了引物合成费用。②反应条件相对固定，试验重复性较好，操作简易。因此，在林木种质资源遗传多样性、品种鉴定等方面应用前景广阔[17-19]。

SRAP-PCR反应体系主要包含5个影响因素，即DNA模板、镁离子、dNTPs、引物和TaqDNA聚合酶。各个因素用量不同，将明显影响扩增效果，进而影响SRAP分子标记的可靠性。高质量DNA的获取是PCR成功的根本性因素，DNA中残留的蛋白、酚类等物质，会抑制DNA聚合酶。本研究中，采用改良的CTAB法提取了较高质量的DNA，符合SRAP-PCR反应要求。

PCR混合物中，DNA模板、引物和dNTPs的磷酸碱基均可与镁离子结合，降低镁离子的实际浓度；而对TaqDNA聚合酶起作用的是游离的镁离子，因此，镁离子加入量应高于dNTPs[13]。本试验中，镁离子浓度比dNTPs高出1.8 mmol·L－1。PCR扩增产物的大小是由引物限定的，引物浓度过高，不仅会促进非特异性产物的合成，而且还会增加引物二聚体的形成，本研究最终选择0.4 μmol·L－1作为引物的优化浓度。

本试验采用传统的单因素法，确立了适合无患子的SRAP-PCR反应体系。利用该体系对12个种源地的无患子进行扩增，得到了稳定清晰的条带，效果良好，说明优化后的体系适宜无患子种质资源的分子标记分析，但需对SRAP引物进行筛选。SRAP-PCR优化体系的建立，为SRAP分子标记在无患子地理种源多态性分析、遗传图谱构建、品种鉴定等方面打下良好的基础。

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