sgf73+在裂殖酵母中的大规模遗传筛选

郭雨辰, 雷秉坤, 邓小龙, 余垚, 吕红

复旦大学生命科学学院, 遗传工程国家重点实验室, 上海 200433

sgf73+在裂殖酵母中的大规模遗传筛选

郭雨辰, 雷秉坤, 邓小龙, 余垚, 吕红

复旦大学生命科学学院, 遗传工程国家重点实验室, 上海 200433

遗传相互作用(Genetic interaction, GI)直接提示了生物体内各个基因在功能上的关联性, 为研究一个基因的潜在功能提供了线索。遗传筛选是研究基因遗传相互作用的重要方法。文章以 SAGA(Spt-Ada-Gcn5 acetyltransferase)复合物去泛素化模块亚基基因sgf73+为查询基因, 在裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)中进行了大规模遗传筛选。结果显示, 164个基因与 sgf73+具有负遗传相互作用, 42个基因具有正遗传相互作用。GO(Gene ontology)分析结果表明, 这些基因富集于染色质修饰、DNA损伤修复、压力应答、RNA转录等生物过程。通过组蛋白修饰检测实验首次发现, sgf73+的缺失导致组蛋白H3K9、H4K16位点乙酰化水平下降, H3K4位点甲基化修饰水平上升。此外, 系列稀释实验显示sgf73Δ菌株对DNA损伤试剂HU和CPT的敏感性提高, 并且Sgf73参与高氧胁迫应答。这些结果显示sgf73+参与了染色质修饰、DNA损伤修复和高氧压力应答过程。

遗传相互作用; 裂殖酵母; sgf73+; 组蛋白修饰; DNA损伤修复; 压力应答

遗传相互作用(Genetic interaction, GI)是研究生物基因型和表型关系之间的桥梁[1,2], 在揭示生物网络的基因冗余性、理解人类重大疾病的分子机制中发挥重要作用[3,4]。遗传筛选是探究基因间遗传相互作用的重要方法。近年来随着高通量筛选技术的快速发展, 使得遗传相互作用的大规模筛选得以实现, 从而为解读生物体中各个基因之间的遗传关系网络、挖掘重要基因的多功能性提供了很好的研究方法。2001年, Tong等[5]在Science上提出合成遗传阵列(Synthetic genetic array, SGA)分析, 为酵母的大规模遗传筛选提供了理论基础。根据酵母细胞生长表型的不同, 遗传相互作用可以分为以下三类: (1)表型加剧(负遗传相互作用), 即双突变体表型强于预期的与之相关的两个单突变体表型, 提示相互作用基因位于平行通路中发挥同一生物学功能; (2)表型减弱(正遗传相互作用), 即双突变体表型弱于预期的与之相关的两个单突变体表型, 提示相互作用基因位于同一通路共同发挥作用; (3)表型不变,即双突变体表型与预期的与之相关的两个单突变体表型一致, 提示基因间没有遗传关联性[6,7]。裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)具有基因组小、生长周期短、易培养等特点, 在进行大规模遗传筛选上具有很大的优势。2002年, 裂殖酵母的全基因组测序完成后, 各种必需基因与非必需基因突变体文库的成功构建也是大规模遗传筛选研究得以顺利进行的主要原因。

SAGA(Spt-Ada-Gcn5 acetyltransferase)复合物是真核生物中高度保守的染色质重塑复合物, 在染色质修饰、转录、DNA损伤修复、mRNA转运等过程中发挥作用。SAGA复合物由21种保守蛋白组成,包括组蛋白乙酰转移酶模块、组蛋白去泛素化模块、TATA结构域结合蛋白作用模块、募集模块和结构模块5部分[8]。Sgf73是较晚发现的一个SAGA复合物亚基, 与Sus1、Sgf11以及酶学活性亚基Ubp8共同组成了 SAGA复合物的去泛素化模块(Deubiquitination module, DUBm)。Sgf73的缺失直接引起去泛素化模块的解离[9], 导致组蛋白H2B泛素化水平整体上调[10]。Shukla等[11]报道在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中Sgf73可以帮助SAGA复合物募集到GAL1启动子上, 促进转录起始复合物的形成;酿酒酵母中Sgf73的缺失影响Sus1与mRNA输出复合物Sac1-Thp1(TREX2)结合, 造成了mRNA前体在细胞核内大量积累[12]。

裂殖酵母与酿酒酵母同属子囊菌纲, 但是两者在 4.2亿年前已经各自分化[13]。由于裂殖酵母在细胞周期、rRNA生物合成、RNAi途径以及基因的表达调控等方面与哺乳动物细胞具有一定的相似性,因此, 近年来在裂殖酵母中开展的研究备受关注。Ryan等[1]选择 876个目的基因, 分别与裂殖酵母中2000个基因进行遗传筛选。通过对160万个双突变体的生长值进行测量, 将获得的遗传关联划分为297个功能模块, 发现了144个参与mRNA剪切、DNA损伤修复等过程的新基因。据此, 作者提出遗传关系在生物进化过程中是保守的, 其保守性在蛋白复合物中最高, 在相关的生物过程中其次, 在无关联的生物过程中最低。裂殖酵母含有5123个基因,其中非必需基因3683个。已有的筛选报道仅覆盖了裂殖酵母非必需基因的 60%, 同时对获得的具有遗传关联的基因缺少深入的功能研究。本研究利用sgf73+作为查询基因, 对3256个非必需基因(覆盖了裂殖酵母非必需基因的88.4%)进行了大规模遗传筛选, 并在组蛋白修饰、DNA损伤以及氧压力应答等方面进一步分析了sgf73+的生物功能。

1 材料和方法

1.1 材料

裂殖酵母基因缺失突变体文库购于 Bioneer公司(S pombe Haploid Mutants Set ver1 0)。该文库共有3256个裂殖酵母基因缺失突变体, 覆盖了裂殖酵母非必需基因总数的 88.4%。这些突变体都是在 h+野生型菌株ED666(h+ade6-M210 ura4-D18 leu1-32)或ED668(h+ade6-M216 ura4-D18 leu1-32)中构建得到的, 筛选标记是G418抗性。构建方法及各突变体基因型参见http://pombe.bioneer.co.kr/网站。

为了进行杂交筛选, 本研究利用同源重组的方法[14], 在 h-野生型菌株(h-ade6-M210 leu1-32 ura4-D18)中, 缺失 sgf73+基因, 获得 sgf73+缺失突变体(h-sgf73::Hyg ade6-M210 leu1-32 ura4-D18), 筛选标记是HYG抗性, 命名为sgf73Δ。

裂殖酵母培养条件及所需培养基参见文献[15]。

1.2 方法

1.2.1 遗传相互作用筛选

利用杂交的方法[16]进行遗传相互作用筛选, 构建 sgf73+与其他非必需基因的双基因缺失突变体菌株。具体过程: 将突变体库菌株与 sgf73Δ菌株分别接种于96孔板YES液体培养基中, 32℃培养3 d。先将各突变体菌液分别点种在 SPAS平板上, 再在同一位置覆盖点种sgf73Δ菌液, 25℃培养3 d。确认产孢后, 将SPAS平板移至45℃培养2 d, 杀死营养体。将孢子转接到96孔板YES液体中, 32℃培养3 d,点种到YES+G418+HYG抗性平板上, 32℃培养3～5 d, 获得双突变体。

SPAS培养基配方: 10 g/L葡萄糖, 1 g/L KH2PO4, 1 mL维生素原液, 45 mg/L腺嘌呤, 45 mg/L组氨酸, 45 mg/L亮氨酸, 45 mg/L尿嘧啶, 45 mg/L赖氨酸(1000×维生素原液: 1 g/L泛酸, 10 g/L烟酸, 10 g/L肌糖, 10 mg/L生物素)。

1.2.2 遗传互作关联分析

将通过杂交获得的双突变体菌株接种于 96孔板YES液体中, 32℃培养4 d。培养液稀释50倍, 取4 μL接种于YES+G418+HYG抗性平板上, 32℃培养2 d。扫描菌斑, 利用 ImageJ软件(ImageJ2.1.4.7, National Institutes of Health)对菌斑灰度进行分析[17]。同时, 将突变体库中的所有单缺失突变体、sgf73Δ菌株、以及野生型菌株进行培养、稀释、点种于各自对应的抗性平板(单缺失突变体为 YES+ G418平板, sgf73Δ菌株为 YES+HYG平板, 野生型菌株为YES平板), 并进行菌斑灰度分析。将突变体库中的单突菌株灰度值与野生型相比, 得到单突菌株生长数值, 记作FxΔ; sgf73Δ菌株与野生型菌株的灰度值之比记作 Fsgf73Δ; 双突菌株与与野生型菌株的灰度值之比记作FxΔsgf73Δ, 根据遗传关系计算公式,为了进一步消除误差, 将所有突变体的G值用log2函数处理后, 将G值小于-0.5定义为负遗传相互作用, G值大于0.5定义为正遗传相互作用, G值介于正负0.5之间定义为没有遗传相互作用。

为了对筛选结果进一步验证, 按照上述方法,将所有G值小于-0.5和G值大于0.5基因的单、双突变体以及 sgf73Δ和野生型菌株重新培养、稀释、点种于YES平板上, 32℃培养2 d, 扫描菌斑, 利用Image J软件进行定量灰度分析, 计算遗传关系。

1.2.3 GO分析

根据 http://amigo.geneontology.org以及 Gene Database网站上关于裂殖酵母各基因的基因信息数据库, 按照所参与的生物过程对筛选得到与 sgf73+具有遗传关系的基因进行了GO分类, 选取的GO不少于3个基因, 并且P≤0.05。

1.2.4 蛋白免疫印迹检测(Western blot)

裂殖酵母组蛋白抽提方法及蛋白免疫印迹检测方法参见文献[19]。用H3K9ac(ab10812)、H4K16ac (07-329)抗体检测组蛋白乙酰化修饰, 用 H3K4mm (ab8895)、H3K4dm(ab7766)、H3K4tm (ab8580)抗体检测组蛋白甲基化修饰, 用H3CTPAN (07-690)抗体检测组蛋白H3作为内参, 利用Image J软件进行条带灰度分析。以上所有抗体均购自 Abcam 和Millipore公司。

1.2.5 系列稀释实验

挑取菌株单克隆接种于3 mL YES液体培养基中, 32℃过夜培养至对数生长期中期(OD600=1-2.5),用分光光度计测量菌液 OD600值, 并用无菌水稀释菌液至起始OD600值为1.0, 再按5倍梯度进行系列稀释。将稀释好的菌液依次取2 μL点种于实验所需固体平板上, 32℃培养2～3 d, 扫描菌斑。本研究中所用各种药物浓度分别为 5 μmol/L CPT、5 mmol/L HU和3 mmol/L H2O2。

2 结果与分析

2.1 sgf73+基因遗传筛选与遗传相互作用分析

图1 sgf73+在裂殖酵母全基因组遗传筛选分析A: 与sgf73+存在负遗传相互作用的基因和正遗传相互作用的基因占据裂殖酵母非必需基因的比例; B: 与sgf73+具有遗传相互作用基因的GO分布(纵轴显示GO中相应的生物学过程, 横轴显示参与到各自生物学过程中的基因数目); C: 与sgf73+遗传互作基因和对应的遗传关系强度(黑线代表负遗传相互作用, 橘红色线代表正遗传相互作用。线段越粗, 表示遗传互作关系越强, 反之亦然。红色圆圈代表新发现的遗传相互作用)。

本研究利用在 h-野生型菌株中构建的 sgf73+缺失突变体sgf73Δ和在h+野生型菌株中构建的裂殖酵母突变体库进行杂交筛选。共得到 206个与 sgf73+具有遗传相互作用的基因, 占非必需基因总数的5.59%, 其中负遗传相互作用基因164个, 占非必需基因总数的4.45%, 正遗传相互作用基因 42个, 占非必需基因总数的 1.14%(图 1A)。与已报道的结果进行对比, 发现其中 134个与 sgf73+具有遗传关系的基因已有报道[1], 包括 SAGA复合物其他成员gcn5+、ngg1+和sgf29+等, 证明了筛选的可靠性。进一步对与sgf73+遗传相互作用的基因进行GO分析,选取P≤0.05的GO进行归类。结果表明, 这些基因主要归属于生物代谢、染色质修饰、细胞周期、压力应答、转录、信号转导、DNA损伤修复等生命过程(图1B)。选取染色质修饰、细胞周期调控、DNA损伤修复和压力应答 4个生物过程中的基因, 根据它们与sgf73+遗传关系强弱程度绘制遗传网络图(图1C)。结果显示, 染色质修饰与细胞周期过程各有26个基因与 sgf73+存在遗传关联, 其中, 染色质修饰基因多参与组蛋白乙酰化、去乙酰化以及甲基化修饰过程(图 1C, 染色质修饰); 而细胞周期相关基因涉及微管形成、纺锤体组装、DNA复制、核分裂等多个过程的调控(图1C, 细胞周期)。此外, 在压力应答模块中, 共有 23个基因与 sgf73+存在遗传互作,其中14个基因的遗传关系是本研究首次发现的, 参与氧压力应答、MAP、离子运输等生物途径(图1C,压力应答)。与染色质修饰、细胞周期调控、压力应答模块相比, 与sgf73+存在遗传关联的DNA损伤修复基因有13个, 包括rhp41+、cds1+、rad24+、rad51+、rhp26+和 cdm1+等多个经典 DNA损伤修复蛋白(图1C, DNA损伤修复), 以上分析结果提示sgf73+可能参与上述生物学过程。

本研究新发现74个基因与sgf73+之间具有遗传相互作用, 其中负遗传相互作用基因 51个, 正遗传相互作用基因23个。新发现的遗传互作基因包括染色质重塑相关基因jmj4+、hat1+和rik1+, DNA损伤修复基因rad51+、rad24+和mag2+, 细胞周期调控基因mad2+、klp3+和csk1+等, 这些基因的发现丰富了sgf73+的遗传关系网络, 为揭示sgf73+在上述生物过程中的作用机制提供帮助。此外, 本研究还筛选到14个参与压力应答的基因、15个参与生物代谢过程的基因、5个参与物质运输的基因以及 5个参与信号转导的基因。sgf73+遗传互作基因在上述生物过程中的富集提示其能够参与这些过程的调控, 但目前尚没有报道证实 sgf73+具有相关生物功能, 这一结果对探究sgf73+的新功能具有很好地指示作用。

2.2 sgf73+的缺失影响组蛋白乙酰化和甲基化修饰

遗传筛选表明sgf73+与26个染色质修饰基因具有遗传相互作用(图 1C, 染色质修饰)。本文对乙酰化修饰相关基因gcn5+和hat1+、去乙酰化修饰相关基因prw1+、甲基化修饰相关基因ash2+与sgf73+的遗传关系进一步分析(图 2A)。将野生型、sgf73Δ、单突菌株以及对应的双突菌株等量接种于YES平板上, 培养相同时间。以野生型的菌斑灰度值作为对照(设为 1.0), 发现 sgf73Δ与其他单突菌斑灰度值介于 0.9～1.0, 对正常生长没有显著影响, 而当 sgf73+与其他基因同时缺失后, 对应的双突菌株生长值低于预期生长值, 说明 sgf73+与上述基因具有遗传相互作用。

因此, 本文推测 sgf73+除了能够调控组蛋白H2B去泛素化外还参与组蛋白乙酰化、甲基化等修饰过程。为了在功能上验证 sgf73+是否参与组蛋白修饰, 本文首先检测WT、sgf73Δ在SAGA复合物乙酰化修饰位点H3K9、H4K16位点处的乙酰化水平,并以SAGA复合物酶学活性亚基gcn5Δ、ubp8Δ作为对照(图2B)。通过ImageJ对条带灰度定量分析发现,与野生型相比, sgf73+的缺失能够引起H3K9、H4K16位点处的乙酰化水平下降, 在 H3K9位点处乙酰化下调水平约为20%, 而在H4K16位点处乙酰化下调水平达到30%。gcn5Δ和ubp8Δ中这两个位点处的乙酰化也有一定程度下降, 但是相对于 sgf73Δ, gcn5Δ中乙酰化下降更剧烈, 而 ubp8Δ中乙酰化下降程度与sgf73Δ基本相同。因此, sgf73+可能依赖SAGA酶学活性的来调控H3、H4乙酰化修饰过程。

Western blot检测H3K4甲基化结果显示(图2C), sgf73+缺失后, H3K4甲基化上升, 而在sgf73Δash2Δ双缺失的菌株中, 甲基化从基本丧失恢复至野生型水平, 这也提示了sgf73Δash2Δ菌株生长变差可能与H3K4甲基化变化没有直接关联, sgf73+与ash2+之间可能还存在其他功能关联。通过gcn5Δ和ubp8Δ对照发现, ubp8+缺失后, 甲基化水平较野生型上调; gcn5+缺失后, 甲基化水平较野生型不变。

通过对遗传关联的深入研究, 本文用实验方法证明了sgf73+的缺失下调了裂殖酵母组蛋白H3K9、H4K16乙酰化, 上调了H3K4甲基化。

2.3 sgf73+基因参与 DNA损伤试剂和高氧压力的应答

图2 sgf73+缺失对组蛋白乙酰化和甲基化修饰的影响A: sgf73+与染色质修饰基因gcn5+、hat1+、prw1+和ash2+的遗传分析。各菌株培养至对数期后, 取等量的菌体点种于YES上, 32℃培养 2 d后扫描; 柱状图为菌斑的平均灰度值。B: sgf73+缺失对组蛋白 H3K9、H4K16乙酰化水平的影响。抽提菌株中的组蛋白进行Western blot检测; 柱状图为条带的灰度值。C: sgf73+缺失对组蛋白H3K4甲基化水平的影响。

遗传筛选结果显示sgf73+与DNA损伤修复、压力应答相关基因具有遗传互作(图 1C), 提示其可能参与上述生物过程。利用系列稀释实验研究 sgf73+基因缺失对DNA损伤试剂HU、CPT以及高氧压力胁迫的影响, 并以gcn5Δ和ubp8Δ作为对照。结果显示(图3A), 在高氧条件下, sgf73Δ菌株生长变慢, 说明 sgf73+对细胞应对高氧环境压力是必需的。而gcn5Δ和 ubp8Δ生长情况无明显变化, 提示 sgf73+参与氧压力应答这一功能不依赖于SAGA酶学活性。此外, sgf73Δ菌株对 HU、CPT的敏感度提高, 且gcn5Δ和ubp8Δ也具有相应表型, 表明了Sgf73乃至SAGA复合物可能在DNA损伤应答过程中发挥重要作用。

通过对氧压力应答基因 ubr1+、rhp6+与 sgf73+的遗传关系进一步分析发现, 当 sgf73+与 ubr1+、rhp6+同时缺失后, 对应的双突菌斑灰度值与野生型和单突相比明显降低, 说明 sgf73+与 ubr1+、rhp6+具有遗传相互作用, 且当sgf73+分别与rhp6+、ubr1+双缺失后, 双突菌株在高氧条件下生长更为缓慢,提示 sgf73+与 rhp6+、ubr1+位于不同通路应对高氧压力(图3B)。sgf73+与14个DNA损伤修复基因具有遗传关联, 其中9个是已经报道的, 5个是本文新发现的(图1C, DNA损伤修复)。进一步挑选已报道的cds1+和新发现的rad51+作为代表, 分别用遗传方法分析了 sgf73+与两者之间的关系。发现用 5 mmol/L HU处理后, sgf73+与 rad51+双缺失菌株与sgf73Δ表型一致, 而 sgf73+与 cds1+双缺失菌株对HU更敏感(图3C), 提示sgf73+与rad51+位于同一遗传通路, 而与cds1+处于不同遗传通路。

图3 sgf73+缺失对DNA损伤试剂和H2O2的影响A: sgf73Δ对DNA损伤试剂敏感性检测。各菌株培养至对数期后, 取等量的菌体点种于YES或含有药物的平板上, 32℃培养2～3 d后扫描。B: sgf73+与氧压力应答基因rhp6+、ubr1+的遗传分析。培养与扫描方式同图A; 柱状图为菌斑的平均灰度值。C: sgf73+与DNA损伤修复基因rad51+、cds1+的遗传分析。

3 讨 论

SAGA复合物是真核生物中高度保守的染色质重塑复合物, 在染色质修饰、转录、DNA损伤修复、mRNA转运等过程中发挥作用。Sgf73是SAGA复合物的去泛素化模块成员, 负责将去泛素化模块锚定在SAGA主体结构上, 与SAGA复合物一起发挥作用。但是, 越来越多的研究表明, 复合物的成员除了参与复合物自身功能之外, 还以不依赖复合物的方式在其他途径中发挥独特作用, 例如 Spt3调控Ccr4-not Complex基因转录[20]。大规模遗传筛选技术已经在酿酒酵母、线虫(Caenorhabditis elegans)等模式生物中得到了广泛的应用, 为深入揭示基因功能提供了可靠的指导作用。本研究利用裂殖酵母全基因组筛选的方法, 获得了与 sgf73+具有负遗传相互作用的基因164个, 正遗传相互作用的基因42个,这些基因分属于生物代谢、压力应答、DNA损伤修复、染色质修饰、信号转导、细胞周期调控以及转录等过程。

组蛋白共价修饰是一种可逆的翻译后修饰作用[21], 各修饰之间相互影响、相互协调, 形成一个复杂的调控网络, 是表观遗传学研究的热点领域。在前期筛选中, 发现sgf73+基因与组蛋白甲基化、乙酰化过程相关基因具有遗传相互作用。通过检测组蛋白修饰水平发现, 在裂殖酵母中 sgf73+缺失致使H3K9、H4K16位点乙酰化下调, 且这一影响依赖于SAGA复合物酶学活性。本研究首次在裂殖酵母中发现 sgf73+参与组蛋白乙酰化修饰过程。本研究还发现, sgf73+参与调控组蛋白 H3K4甲基化过程。sgf73+缺失后组蛋白H3K4位点一甲、二甲和三甲甲基化修饰水平均有上调, ubp8+缺失后对H3K4甲基化的影响与sgf73+相同, 而gcn5+对H3K4甲基化无明显影响, 提示 sgf73+对 H3K4甲基化的调控依赖SAGA复合物去泛素化模块的去泛素化功能。研究表明, 组蛋白 H2BK123位点的泛素化修饰位于H3K4位点甲基化的上游, 对H3K4甲基化修饰是必需的[22]。Rad6直接负责该位点的泛素化, 而SAGA复合物Ubp8负责该位点的去泛素化, Rad6与Ubp8通过组蛋白crosstalk的形式间接调控H3K4甲基化。Sgf73作为 SAGA复合物去泛素化模块的成员, 它的缺失能够引起H2B整体水平的泛素化上调。因此本研究推测, 在野生型情况下, sgf73+负责协助ubp8+完成对H2BK123的去泛素化修饰, 抑制H3K4甲基化; 而在sgf73+或ubp8+缺失时, H2BK123的泛素化水平上调, 从而激发H3K4甲基化, 因此sgf73+对H3K4甲基化的影响依赖于SAGA复合物DUB模块。

DNA损伤应答和压力应答是生物抵抗外界环境刺激、维持正常生命活动所必需的[23,24]。SAGA复合物主要调控压力诱导型基因的表达, 且其主要亚基Gcn5、Spt7、Spt20参与DNA损伤应答[25]。系列稀释实验表明sgf73+基因对DNA损伤试剂及高氧胁迫产生应答, 提示sgf73+能够参与DNA损伤和压力应答过程。Rad51是参与DNA同源重组(HR)修复的重要蛋白, 它能够与受损的单链DNA结合形成复合物, 从而募集下游损伤修复蛋白, 启动同源重组修复过程[26]。遗传分析结果显示, sgf73+与rad51+位于同一遗传通路, 推测sgf73+可能参与了DNA同源重组修复过程。

组蛋白修饰在 DNA损伤修复和染色质重塑过程中发挥直接或间接作用。已有报道表明, 在DNA重组修复过程中, 乙酰转移酶Gcn5、Hat1和H4K16特异性去乙酰化酶Sir2能够募集到DNA损伤处, 直接参与损伤修复后的染色质重塑过程[27,28]。SAGA复合物对组蛋白H2B的去泛素化是H3K79三甲基化所必需的[29], H3K79甲基化能够募集DNA损伤修复蛋白53PB1/Rad9至DNA双链断裂处帮助修复损伤, 因此H2B去泛素化可以通过影响甲基化修饰过程间接参与DNA损伤修复。本研究发现, sgf73+缺失既影响组蛋白H3K9、H4K16乙酰化水平和H3K4甲基化水平, 又能够应答DNA损伤试剂HU、CPT,提示sgf73+可能通过调控组蛋白修饰水平参与DNA损伤修复和压力应答过程。

综上所述, 本文通过对 sgf73+的大规模遗传筛选研究, 发现并鉴定了多个与 sgf73+发生遗传相互作用的新基因, 这一系列的结果为 sgf73+的作用机制的研究提供了新的线索。此外, 通过SMART蛋白结构域分析发现, Sgf73蛋白含有SCA7结构域, 该结构域从酵母到人中高度保守, 提示 sgf73+基因功能在真核生物中存在进化关联性。因此, 本研究结果为其他真核生物中 sgf73+的功能研究提供了借鉴。

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(责任编委: 何 群)

Large scale screening of genetic interaction with sgf73+in fission yeast

Yuchen Guo, Bingkun Lei, Xiaolong Deng, Yao Yu, Hong LV

State Key Laboratory of Genetic Engineering, School of Life Sciences, Fudan University, Shanghai 200433, China

Genetic interaction (GI) not only suggests functional correlations between different genes in vivo, but also provides clues for understanding the potential biological function of a specific gene. Screening of GI is an important method for understanding GI between different genes. In this study, we selected sgf73+as a query, which encodes a subunit of SAGA (Spt-Ada-Gcn5 acetyltransferase) complex deubiquitination module, to perform a large scale screening of GI in fission yeast. Our data showed that 164 genes had negative GIs whereas 42 genes had positive GIs with sgf73+. GO (Gene ontology) analysis indicated that these genes were enriched in several important biological processes, including chromatin modification, DNA damage repair, cellular response to stress, RNA transcription and so on. By using histone modification detection, we showed for the first time that loss of sgf73+led to a decreased level of histone acetylation at H3K9 and H4K16 and an increased level of histone H3K4 methylation. Furthermore, the spot assay results showed that the sgf73Δ cells exhibited increased sensitivity to DNA damage agents, HU and CPT, and sgf73+was involved in responses to hyperoxia stress.All these results suggested that sgf73+plays important roles in chromatin modification, DNA damage repair and hyperoxia responses.

genetic interaction; fission yeast; sgf73+; histone modification; DNA damage repair; response to stress

2014-01-26;

2014-04-16

国家重点基础研究发展计划(973计划)项目(编号：2009CB825601)和国家自然科学基金项目(编号：31200961)资助

郭雨辰，硕士研究生，专业方向：微生物遗传学。E-mail: 11210700149@fudan.edu.cn

吕红，教授，研究方向：微生物遗传学。E-mail: honglv@fudan.edu.cn

10.3724/SP.J.1005.2014.0723

时间: 2014-5-6 15:12:41

URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1913.R.20140506.1512.002.html