高效液相色谱法测定己酮可可碱肠溶片中己酮可可碱含量

孟祥云，代文婷，高雷，邢海燕，陈进（安徽医科大学附属合肥医院/合肥市第二人民医院药学部，安徽合肥230011）

高效液相色谱法测定己酮可可碱肠溶片中己酮可可碱含量

孟祥云，代文婷，高雷，邢海燕，陈进（安徽医科大学附属合肥医院/合肥市第二人民医院药学部，安徽合肥230011）

目的建立测定己酮可可碱肠溶片中己酮可可碱含量的方法。方法采用高效液相色谱法测定己酮可可碱含量。色谱柱：COSMILC18柱（4.6 mm×250.0 mm，5.0 μm）；检测波长：272 nm；流动相：甲醇-0.544%磷酸二氢钾溶液（48∶52）；柱温：30℃；流速：1.0 mL/min；进样量：20 μL。结果己酮可可碱质量浓度为60.25～140.59 μg/mL时峰面积与浓度呈良好的线性关系（R2=1.000）。3批样品的平均含量分别为99.91%、99.95%、99.89%。结论高效液相色谱方法专属性强、方便、快捷，适用于测定己酮可可碱肠溶片中己酮可可碱的含量。

色谱法，高压液相；己酮可可碱；肠溶片

己酮可可碱为可可豆碱的衍生物，是非选择性磷酸二酯酶抑制药，为非特异性外周血管扩张药[1]。己酮可可碱及其代谢产物通过降低血液黏度而改善血液流变性，可增加慢性外周动脉血管疾病患者受累微循环的血流，提高其组织供氧量[2]。该药可剂量依赖性地降低血液黏度、提高红细胞变形性、改善白细胞的血液流变特性，并能抑制嗜中性粒细胞的黏附和激活。其主要适用于脑部血液循环障碍如暂时性脑缺血发作、脑卒中后遗症、脑缺血引起的脑功能障碍[3]；保护心血管，改善慢性心力衰竭及特发性扩张性心肌病患者心功能的作用[4]；外周血液循环障碍性疾病如血栓栓塞性脉管炎、腹部动脉血液循环障碍、间歇性跛行或静息痛、神经病理性疼痛[5]；内耳循环障碍如突发性耳聋、老年性耳鸣及耳聋；眼部血液循环障碍[6]。有研究表明，己酮可可碱尚可治疗女子不孕症及男子不育症[7-9]。该药生物半衰期短、血药浓度波动大，可引起胃肠道和中枢神经系统的不良反应。将其研制成肠溶制剂，以减少其不良反应[10-11]。为进一步控制制剂的质量，该研究建立了高效液相色谱法测定己酮可可碱肠溶片中己酮可可碱的含量。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 仪器Agilent 1100高效液相色谱仪，DAD检测器，AB135-S型1/100 000天平（德国梅特勒公司），BCD-225CHC冰箱（合肥美菱公司），KQ-300B型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司），UV-1750紫外分光光度计（日本岛津公司）。

1.1.2 试剂己酮可可碱对照品（中国药品生物制品检定所提供，批号：100591-200501）、咖啡因对照品（中国药品生物制品检定所提供，批号：17125-200809）、己酮可可碱肠溶片（自制）、娃哈哈纯净水（杭州娃哈哈非常可乐有限公司，批号：20130213）、甲醇为色谱纯、其他试剂均为分析纯。

1.2 方法

1.2.1 色谱条件色谱柱：COSMILC18柱（4.6mm×250.0mm，5.0μm）；流动相：甲醇-0.544%磷酸二氢钾溶液（48∶52）；检测波长：272 nm；柱温：30℃；流速：1.0 mL/min；进样量：20 μL。

1.2.2 对照品溶液的制备称取咖啡因对照品5.32 mg，己酮可可碱对照品5.14 mg置于100 mL量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。

1.2.3 阴性对照溶液的制备按处方比例，称取除己酮可可碱外的辅料62.3 mg，置于50 mL量瓶中，加流动相超声溶解10 min并稀释至刻度，摇匀，滤过，量取续滤液5 mL置于25 mL量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，作为阴性对照溶液。

1.2.4 供试品溶液的制备取本品20片，精密称定，充分研细，称取230.30 mg置于50 mL量瓶中，加流动相超声溶解10 min并稀释至刻度，摇匀，滤过，量取续滤液5 mL置于25 mL量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。

1.2.5 方法学验证

1.2.5.1 专属性试验分别精密量取10 μL供试品溶液、对照品溶液、阴性对照品溶液注入高效液相色谱仪，在1.2.1项色谱条件下测定。

1.2.5.2 线性回归精密称取己酮可可碱对照品50.21 mg，置于50 mL量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀。精密量取3.0、4.0、5.0、6.0、7.0 mL，分别置于50 mL量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，分别精密量取各对照品溶液10 μL注入高效液相色谱仪，在1.2.1项色谱条件下测定，记录峰面积。以峰面积（A）对浓度（C）作图并进行线性回归。

1.2.5.3 精密度试验称取己酮可可碱对照品19.63、20.06、19.38、24.61、25.10、24.43、29.11、30.09、29.41 mg置于50 mL量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，量取5 mL置于25 mL量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀。分别量取各对照品溶液10 μL注入高效液相色谱仪，在1.2.1项色谱条件下测定，记录峰面积，计算相对标准偏差（RSD）。

1.2.5.4 中间精密度试验称取己酮可可碱对照品19.47、18.80、19.03、23.65、23.69、23.91、28.67、28.01、29.20 mg置于50 mL量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，量取5 mL置于25 mL量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，分别量取各对照品溶液10 μL，在不同时间，由不同人员在不同机器上测定峰面积。

1.2.5.5 回收率试验称取己酮可可碱对照品25.21mg，置于50mL量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取5 mL置于25 mL量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。称取己酮可可碱对照品20.11、19.44、19.75、24.27、24.64、24.53、29.83、29.16、30.14 mg分别置于50 mL量瓶中，按处方比例加入空白辅料，加流动相超声并稀释至刻度，振摇，滤过，量取续滤液5 mL置于25 mL量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。分别量取对照品溶液和供试品溶液10 μL注入高效液相色谱仪，在1.2.1项色谱条件下测定，记录峰面积，计算回收率。

1.2.5.6 溶液稳定性试验称取己酮可可碱对照品25.13 mg，置于25mL量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取5 mL置于50 mL量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。精密称取本品118.3 mg，同法制备供试品溶液。分别在0、1、2、4、6、8 h测定对照品溶液和供试品溶液的峰面积。

1.2.5.7 含量测定称取己酮可可碱对照品23.62 mg置于50 mL量瓶中，加流动相超声溶解10 min并稀释到刻度，摇匀，滤过，量取续滤液5 mL置于25 mL量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。取本品20片，精密称定，充分研细，精密称取适量，置于50 mL量瓶中，加流动相超声溶解10 min并稀释至刻度，摇匀，滤过，量取续滤液5 mL置于25 mL量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。分别精密量取对照品溶液和供试品溶液10 μL注入高效液相色谱仪，在1.2.1项色谱条件下测定，记录峰面积，计算含量。作者制备样品3批，批号分别为130501、130502、130503，每批分别取样品。

2 结果

2.1 专属性试验辅料峰对己酮可可碱的含量测定无干扰，咖啡因峰与己酮可可碱峰的分离度为7.5，理论塔板数按己酮可可碱峰计算为8 020，己酮可可碱保留时间为5.35 min。结果表明该方法专属性强。见图1、2、3。

2.2 线性回归线性方程：A=19.222C+10.777，R2=1.000。结果表明，己酮可可碱质量浓度为60.25～140.59 μg/mL时，峰面积与浓度呈良好的线性关系。

2.3 精密度试验RSD为0.10%，表明该方法精密度良好，符合方法学要求。

2.4 中间精密度试验RSD为0.14%，表明该方法精密度良好，符合方法学要求。

图1 对照品溶液色谱图

图2 阴性对照溶液色谱图

图3 供试品溶液色谱图

2.5 回收率试验平均回收率为99.95%，RSD为0.40%。结果表明，回收率试验中己酮可可碱与空白辅料不发生吸附作用，可以认为其对含量测定基本无影响，此法符合要求。

2.6 溶液稳定性试验该制剂在8 h内稳定性良好。

2.7 含量测定见表1。

表1 样品含量测定结果

3 讨论

3.1 己酮可可碱为可可豆碱的衍生物，该药生物半衰期短、血药浓度波动大，可引起胃肠道和中枢神经系统的不良反应。己酮可可碱可引起胃肠道不良反应，作者将其研制成肠溶制剂。

3.2 选择己酮可可碱最大吸收波长272 nm为分析波长，检测灵敏度高，辅料不干扰分析测定。使用甲醇-0.544%磷酸二氢钾溶液（48∶52）为流动相，咖啡因峰与己酮可可碱峰的分离度好，理论塔板数高，己酮可可碱保留时间合适，因此该色谱条件适合该制剂的含量测定。

3.3 参照《中国药典2010年版二部附录ⅤD》，本研究采用高效液相色谱法测定己酮可可碱肠溶片中己酮可可碱的含量，结果显示，各批号制剂之间己酮可可碱的含量差异很小，本研究结果表明，该方法操作简便、结果准确、重现性好，因此，该方法可作为该制剂质量控制的方法。

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Content determination of pentoxifylline in pentoxifylline enteric-coated tablets by HPLC

Meng Xiangyun，Dai Wenting，Gao Lei，Xing Haiyan，Chen Jin（Department of Pharmacy，the Affiliated Hefei Hospital of Anhui Medical University/Hefei Municipal Second People′s Hospital，Hefei，Anhui 230011，China）

ObjectiveTo establish a method for the content determination of pentoxifylline in pentoxifylline entericcoated tablets.MethodsHigh-performance liquid chromatography（HPLC）was used to determine the content of pentoxifylline. The chromatographic column was COSMILC18（4.6 mm×250.0 mm，5.0 μm）；the detection wavelength was 272 nm；the mobile phase was methanol-0.544%monopotassium phosphate（48∶52）；the column temperature was 30℃；the flow velocity was 1.0 mL/min，and the injection volumn was 20 μL.ResultsWhen the concentrations of pentoxifylline was in the range of 60.25-140.59 μg/mL，the peak area had good linear relationship with concentration（R2=1.000）.The average contents of pentoxifylline in three batches of samples were 99.91%，99.95%，99.89%respectively.ConclusionThe HPLC is specific，convenient and fast，it is suitable for content determination of drugs in pentoxifylline enteric-coated tablets.

Chromatography，high pressure liquid；Pentoxifylline；Enteric-coated tablets

10.3969/j.issn.1009-5519.2014.09.015

A

1009-5519（2014）09-1315-02

2013-12-20）

孟祥云（1970-），男，安徽肥东人，主管药师，主要从事药事管理及临床药学工作；E-mail：hfmxy70@163.com。