Aβ1-42诱导HUVEC细胞凋亡最适浓度与时间选择*

蔡鹏飞，刘明华，冯林林，刘俊红，尤朝菲，章卓（泸州医学院:科技处；药学院药理教研室；中药学本科00级，四川泸州646000）

Aβ1-42诱导HUVEC细胞凋亡最适浓度与时间选择*

蔡鹏飞，刘明华1，冯林林2，刘俊红2，尤朝菲2，章卓1
（泸州医学院:科技处；1药学院药理教研室；2中药学本科2010级，四川泸州646000）

目的:探讨β样淀粉肽1-42（Aβ1-42）诱导人脐静脉血管内皮细胞株（HUVEC）细胞凋亡的最适浓度和时间。方法:体外培养HUVEC，将Aβ1-42分为5×10-4、5×10-3、5×10-2、5×10-1、5、5×10、5×102μmol/L 7个浓度，分别刺激0.5、2、6、12、24、48 h后，采用CCK-8法观察细胞活力，荧光显微镜观察Hochest33342/PI双染后细胞形态。结果：同阴性组比较，Aβ1-42浓度≥5μmol/L刺激48 h均可引起细胞活力明显下降（P＜0.05）。5×10，5×102μmol/L刺激24 h可引起HUVEC细胞活力下降，但48h HUVEC细胞活力下降更明显（P＜0.05）。Hochest33342/PI双染可见明显核浓缩和凋亡小体的产生，甚至出现死亡现象。结论:Aβ1-42刺激后引起HUVEC细胞活力下降呈时间与剂量依赖性，综合时间与剂量考虑，5×10μmol/L刺激24h可致理想的HUVEC细胞凋亡模型。

β样淀粉肽1-42；HUVEC细胞；细胞凋亡

β-淀粉样蛋白(β-amyloid protein，Aβ)异常沉积、细胞凋亡在阿尔茨海默病(Alzheimerdisease，AD)的发病中起着重要作用，β-淀粉样蛋白由39～43个氨基酸组成，聚集态的Aβ1-42可以导致神经细胞凋亡，损伤神经细胞[1]。血管内皮细胞衬覆于血管内壁，构成血管通透性的主要屏障，有调节细胞代谢产物、调节血管舒张、止血和趋化白细胞的作用[2]。β-淀粉样蛋白致阿尔茨海默病病人血管内皮产生炎症、凋亡在AD的发病中越来越受到重视[3]，因此深入探索β-淀粉样蛋白致血管内皮细胞损伤与凋亡规律，寻找保护内皮的措施有重要意义。目前虽然有学者对Aβ1-42致人脐静脉血管内皮细胞（human umbilical vein endothelialcells,HUVEC）凋亡有少量研究，但是尚未对Aβ1-42引起HUVEC凋亡的最适时间和剂量进行研究，故本研究通过对体外培养的人脐静脉内皮细胞施以不同浓度Aβ1-42处理，检测在各时间点的细胞凋亡率，分析不同浓度Aβ1-42诱导内皮细胞凋亡的差异，为深入研究阿尔茨海默病血管内皮损伤的发病机理提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试剂

Aβ1-42（北京奥普森有限公司）；HUVEC细胞（泸州医学院功能性食品与药品研究中心惠赠）；Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒（Keygen公司，批号20101202）；Hoechst 33342以及PI（Sigma，USA）；RPMI1640培养基，胎牛血清（hyclone，USA）；CCK-8试剂盒（碧云天生物技术研究所）。

1.1.2 仪器

超净工作台（苏州净化设备有限公司，SW-CJ-1F型）；倒置相差显微镜（日本Olympus公司，CKX41型）；CO2培养箱（日本Sanyo公司，MCO-15AC型）；离心机（北京医用离心机厂，LG10-3A型）；酶标分析仪（北京普朗新技术有限公司，DNM-9602型）；流式细胞仪（美国BD公司，SBK-YLQX-003552型）。

1.2 方法

1.2.1 CCK-8法检测HUVEC细胞活性

将Aβ1-42溶于超净水，配成500μmol/L母液分装，-20℃冻存，使用前于37℃孵育1周，使其变为聚集状态。HUVEC细胞株培养液为RPMI1640+10%胎牛血清+青链霉素，5%CO237℃培养箱中培养。每3～4 d传代1次。倒置显微镜观察细胞生长情况。

取对数生长期的HUVEC细胞，0.25%胰酶制成单个细胞悬液，细胞浓度为1×105/L接种于96孔板，每孔90μl，培养24h待其贴壁后加药。每个浓度3个复孔，Aβ1-42组（Aβ1-42+细胞）分为5×10-4、5×10-3、5×10-2、5×10-1、5、5×10、5×102μmol/L7个浓度，阴性组（细胞+培养基）加等体积RPMI1640培养基，培养时间为0.5、2、6、12、24、48h，之后每孔加入CCK-810μl继续培养1 h，酶标仪450 nm波长下检测各孔吸光度值，以OD值反应细胞活力情况，连续重复3次。

1.2.2 Hochest33342/PI双染检测HUVEC细胞凋亡

HUVEC细胞培养同1.2.1，根据1.2.1结果，选择Aβ1-425、5×10、5×102μmol/L处理24 h后Hochest33342/PI双染检测HUVEC细胞凋亡。收集细胞悬浮于1ml培养基中，加入10μl Hochest 33342储存液(100mg/L，蒸馏水溶解)，染色15min；将细胞置于冰上冷却后，离心，去上清，将细胞重悬于1m lPBS中，加人5μlPI储存液(1g/L，蒸馏水溶解)，混匀，荧光显微镜观察。

1.2.3 统计学处理

实验数据以x±s表示，数据分析采用单因素方差分析，组间均值比较采用SNK法。P＜0.05表示差异有统计学意义。统计学数据用SPSS13.0软件分析处理。

2 结果

2.1 不同浓度Aβ1-42在不同处理时间对HUVEC细胞活力影响

不同浓度Aβ1-42处理0.5 h与2 h对HUVEC细胞活性没有明显影响，与阴性组比较无统计学差异（P＞0.05）；5×102μmol/LAβ1-42在处理6、12、24、48h后抑制HUVEC细胞活性，同阴性组比较有统计学意义（P＜0.05），其中48 h同阴性对照组比较有显著意义（P＜0.01）；5×10μmol/LAβ1-42在处理24h,48h后抑制HUVEC细胞活性，同阴性组比较有统计学意义（P＜0.05）；5μmol/LAβ1-42处理48h抑制HUVEC细胞活性，同阴性对照组比较有统计学意义（P＜0.05）。5×10-4、5×10-3、5×10-2、5×10-1μmol/LAβ1-42在各时间段对HUVEC细胞活性无明显影响（P＞0.05），见图1。

图1 Aβ1-42不同浓度和不同处理时间对HUVEC细胞活力影响

2.2 不同浓度Aβ1-42诱导HUVEC细胞24 h后细胞形态变化

Hochest33342/PI双染显示，阴性对照组细胞形态呈圆形，淡蓝色，无凋亡细胞。Aβ1-425、5×10、5×102μmol/L三组细胞均可见部分呈凋亡特征性改变，细胞核呈亮蓝色染色，随浓度增加凋亡细胞较多，还可见死亡细胞（红色），见图2。

图2 不同浓度Aβ1-42刺激HUVEC细胞24 h后凋亡影响(×200)

3 讨论

阿尔茨海默病患者由于神经元营养的缺乏、缺氧、代谢物堆积、Aβ1-42沉积等出现血管内皮的损伤，Aβ1-42在毛细血管的沉积不仅造成毛细血管的闭塞，并可引起脑血流量的失调。用Aβ1-42损伤原代培养的脑微血管内皮细胞，可以造成内皮细胞连接遭到破坏，细胞连接蛋白受到损伤，毛细血管发生了变性和退化，失去了原来的形状[4-5]。Aβ1-42致HUVEC细胞凋亡可部分模拟阿尔茨海默病的血管内皮损伤，但是对于Aβ1-42刺激的时间与浓度却因实验室不同而存在差异，本实验目的在于筛选出Aβ1-42刺激HUVEC细胞建立损伤凋亡模型的最适浓度和时间。

在本实验中，选择了Aβ1-425×10-4、5×10-3、5×10-2、5×10-1、5、5×10、5×102μmol/L 7个浓度及0.5、2、6、12、24、48 h 6个时间点。实验结果显示随浓度增加和处理时间的延长，对HUVEC细胞活性影响较大。所有剂量在处理0.5h与2h后几乎对HUVEC细胞活性没有影响；5μmol/L处理48h可使HUVEC细胞活性受到影响。5×10μmol/L处理时间更短一些，24h可抑制HUVEC细胞生长；5×102μmol/L处理6 h即可抑制HUVEC细胞生长。从上述结果中我们可以看出，Aβ1-425×102μmol/L造模效果最佳，但剂量明显偏大，适合处理时间较短，经济充裕的实验；Aβ1-425×10μmol/L与5μmol/L较为合适，因此可以从经济和时间角度上可以考虑Aβ1-425×10μmol/L刺激24 h造模或者5μmol/L刺激48 h。从Hochest 33342/PI双染结果显示，Aβ1-425、5×10、5×102μmol/L刺激24 h后即可见部分呈凋亡特征性改变，5×10、5×102μmol/L凋亡细胞更多，5×102μmol/L则死亡细胞较多。

综上，Aβ1-42刺激后引起HUVEC细胞活力下降呈时间与剂量依赖性，本实验综合凋亡结果、经济性、时间等多种因素认为，Aβ1-425×10μmol/L刺激24h是致HUVEC细胞凋亡的理想剂量和时间。

1.Ma JF,W ang HM,LiQY,etal.Starvation triggersAbeta42 generation from humanumbilicalvascularendothelialcells[J]. FEBSLett，2010，584(14):3101～3106.

2.Yu H,Yang M,W ang Y,etal.p75NTR ismainly responsible for Aβtoxicity but not for its internalization:a primary study[J].NeurolSci,2012,33(5):1043～1050.

3.Belyaev ND,NalivaevaNN,Makova NZ,etal.Neprilysin gene expression requires binding of the amyloid precursor protein intracellular domain to itspromoter:implications for Alzheimerdisease[J].EMBO Rep,2009,10(1):94～100.

4.Thal DR,Capetillo-Zarate E,Larionov S,et al.Capillary cerebralamyloid angiopathy isassociated w ith vessel occlusionand cerebralblood flow disturbances[J].NeurobiolAging,2009,30(12):1936～1948.

5.SoniaM arco,Stephen D.Skaper Am yloid-peptide l-42 alters tight junction protein distribution and expression in brain m icrovessel endothelial cells[J].Neuroscience Letters，2006,401:219～224.

（2013-9-26收稿）

Screen of theoptim alconcentration and incubution tim eofAβ1-42in inducingapoptosisofHUVEC cell

CaiPengfei,LiuMinghua1,Feng Linlin2,Liu JunHong2,You Caofei2,Zhang Zhuo1
Department of Science and Technology;1Department of Pharmacology；2Undergraduate of Luzhou Medical CollegeChineseMateriaMedicaClass2010,LuzhouMedicalCollege

Objective：To screen the optimal concentration and incubation time ofβ-amyloid 1-42 in inducing apoptosis of Human umbilical vein endothelial cells(HUVEC).Methods：HUVEC were cultivated in vitro.β-amyloid 1-42 was diluted into 5×10-4，5×10-3，5×10-2，5×10-1，5，5×10，5×102μmol/L；the incubation time was set at 0.5，2，6，12，24 and 48 h.The cell viability was observed by CCK-8 and the cell morphology was observed by fluorescencemicroscopy after dyeing with Hochest33342/PI.Resu lts:Compared with negative control group,cell viability of all the groups with Aβ1-42≥5μmol/L after stimulating 48 hours was decreased significantly（P＜0.05).The viability of HUVEC incubated with 5×10 and 5×102μmol/Lβ-amyloid 1-42 for 24 hours or 48 hourswas decreased significantly（P＜0.05）.The nuclear enrichmentand apoptotic body could be observed by Hochest33342/PI.Conc lusion:HUVEC cell viability decreased in a time and dose related way after incubated withβ-amyloid1-42.Considering of the time and dose comprehensively, incubation with 5×10μmol/Lβ-amyloid 1-42 for 24 hours can establish the idealmodel ofHUVEC apoptosis.

β-amyloid 1-42；HUVEC；Apoptosis

R967

A

10.3969/j.issn.1000-2669.2014.02.012

*四川省教育厅课题（102c099）；泸州市科技局课题（2012s36）作者简介:蔡鹏飞(1981-)，男，讲师，E-mail:35989298@qq.com

章卓（1979-），男，副教授，E-mail:zhhuozhang-100@163.com