ApoE基因敲除对小鼠B、T淋巴细胞的影响

石桂英，张海涛，张连峰，白 琳

(中国医学科学院北京协和医学院实验动物研究所，卫生部人类疾病比较医学重点实验室，北京 100021)

载脂蛋白E(apolipoprotein E，Apo E)是一种多态性蛋白，参与脂蛋白的转化与代谢过程，其基因可以调节多种生物学功能［1］。Apo E基因敲除后，小鼠的B淋巴细胞及T淋巴细胞发生改变［2］，Apo E在造血干祖细胞中表达丰富，Apo E基因敲除小鼠喂饲高脂、高胆固醇饲料后，造血干祖细胞显著增多［3］，这说明在高脂、高胆固醇可以诱导 Apo E基因敲除小鼠造血干祖细胞增殖。那么在没有高脂、高胆固醇诱因下，Apo E基因对小鼠造血干祖细胞有没有影响呢?

造血干细胞是所有成熟血细胞维持的重要因素。在生理状态下，造血干细胞面临多种命运选择:自我更新、分化、凋亡、静息或迁移，这些选择之间的平衡决定了造血干细胞的功能［4］。不同命运的选择是由内在(细胞周期、凋亡等相关基因)和外在(微环境)的调控机制共同决定的［5］。但是造血干细胞维持自我更新和选择分化的具体机制还不清楚。

那么Apo E对造血系统有怎样的作用，是否会影响骨髓造血干细胞(hematopoietic stem cell，HSC)的发育分化呢?为了解Apo E基因敲除是否会影响HSC，我们应用Apo E基因敲除小鼠及同窝野生对照小鼠进行了相关分析。

1 材料和方法

1.1 动物与设备

Apo E基因敲除小鼠来自北京协和医学院比较医学中心，遗传背景为C57B6/L，对照小鼠为同窝野生型小鼠，动物生产及使用许可证号:SCXK(京)2009－0007;SYXK(京)2011－0022。动物饲养在SPF动物房，喂饲SPF级小鼠维持饮料。

主要实验设备为美国BD公司Aria流式细胞仪。

1.2 PCR方法鉴定Apo E基因敲除小鼠基因型

用10日龄小鼠尾尖提取基因组 DNA，普通PCR鉴定基因型。反应条件:94℃预变性3 min;94℃ 30 s，68℃ 30 s，72℃ 30 s，35 个循环;72℃延伸10 min。基因敲除小鼠的 PCR鉴定引物:OIMR0180:5`GCC TAG CCG AGG GAG AGC CG 3`，OIMR 0181:5`TGT GAC TTG GGA GCT CTG CAG C 3`，OIMR 0182:5`GCC GCC CCG ACT GCA TCT 3`，PCR产物长度，野生型为155 bp，Apo E敲除为245 bp，杂合子同时有上述2条片段。引物由上海英骏生物工程技术有限公司合成，PCR试剂购自宝生物工程有限公司。

1.3 流式分析

小鼠2月龄时脱颈椎处死，取外周血、胸腺、脾脏、后肢骨，置于冰上预冷的染色缓冲液(含1%BSA的PBS)中。胸腺、脾脏用磨砂玻片研磨成细胞悬液;后肢骨用5 mL注射器将骨髓细胞冲出，并吹打成细胞悬液。将细胞悬液用50 μm尼龙滤膜过滤后收集到15 mL离心管中，用PBS定容至10 mL，混匀后，取10 μL细胞悬液，稀释10倍后计数细胞数。细胞悬液离心，1000 r/min，10 min，将细胞浓度调整为1×108个细胞/mL。分别取106细胞标记荧光抗体(BD公司)。

骨髓造血干细胞的分析中用如下抗体进行标记:CD34－FITC、Flt3－PE、CD16/32－ Pcrcp－cy5.5、Sca1－ PE－Cy7、cKit－ APC、Ter－119－ Biotin、Gr－1－Biotin、Mac－1－ Biotin、B220－ Biotin、IL－7R－ Biotin、CD4－Biotin、CD8－Biotin、Biotin －APC－Cy7。骨髓造血干细胞(HSC)表面标记为:lin－c－kit+sca1+，长期造血干细胞(LT－HSC)表面标记为:Lin－ c－Kit+Sca1+CD34－Flt3－，短期造血干细胞(ST－HSC)表面标记为:Lin－c－Kit+Sca1+CD34+Flt3－，髓系祖细胞(MP)表面标记为:Lin－c－Kit+Sca1－，共同髓系祖细胞(CMP)表面标记为:Lin－ c－Kit+Sca1－CD34+CD16/32low，粒单系祖细胞(GMP)表面标记为:Linc－Kit+Sca1－CD34+CD16/32high，巨核单系祖细胞(MEP)表面标记为:Lin－c－Kit+Sca1－CD34－CD16/32low，淋系共同祖细胞(CLP)的表面标记为:Lin－ckitlowSca1lowCD34+IL － 7R+。IgD－FITC、CD43－PE、B220－PE－Cy7、IgM－APC，标记不同发育阶段的 B 淋巴细胞。脾脏及外周血细胞标记抗体:CD4－FITC、CD8－Pcrcp－cy5.5、B220－PE－Cy7、CD11B－ APC－Cy7。上述抗体加入细胞悬液，冰上避光，30 min;加1 mL染色缓冲液，离心，2600 r/min，5 min，弃上清，加200 μL染色缓冲液重悬细胞，用50 μm尼龙滤膜过滤，冰上避光备用。

1.4 统计分析方法

数据分析采用SPSS13.0软件包进行统计分析，各组数据均采用±s表示。组间资料分析采用t检验。以P ＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PCR鉴定结果

剪取10日龄小鼠脚趾，采用饱和氯化钠法提取小鼠基因组DNA，进行PCR，产物经2%琼脂糖凝胶电泳，野生型产物长度为155 bp，Apo E缺失产物长度245 bp。基因型鉴定结果(图1)。

2.2 Apo E基因敲除小鼠外周血B细胞、T细胞减少

我们取Apo E基因敲除小鼠及同窝野生对照小鼠的外周血进行分析，发现Apo E基因敲除小鼠外周血中B220+细胞(P＜0.05)及T淋巴细胞(P＜0.01)显著减少，而CD11b+细胞则没有显著变化(P＞0.05)。

注:Marker为2000 bp DNA Marker，7－15为小鼠编号，+/－为杂合对照，H2O为阴性对照。图1 Apo E基因敲除小鼠鉴定结果Note:Marker:2000 bp DNA marker;7 －15:No.of different mice;+/－:heterozygous control;H2O:negative control.Fig.1 Genotyping of Apo E knockout mice

注:Apo E+/+:同窝野生对照小鼠，Apo E－/－:Apo E基因敲除小鼠。图2 Apo E基因敲除影响外周血B220+细胞及T淋巴细胞Note:Apo E+/+:wildtype control mice;Apo E－ /－:Apo E gene knockout mice.Fig.2 Apo E gene knockout influences the B220+cells and T lymphocytes of peripheral blood

2.3 Apo E基因敲除对小鼠骨髓及脾脏中B220+细胞的影响

Apo E基因敲除小鼠外周血中B220+细胞减少，本研究对骨髓及脾脏的细胞进行了分析，同时对骨髓中前体B细胞的发育也进行了分析。结果发现，Apo E基因敲除小鼠脾脏B220+细胞减少(P＜0.05)，但是骨髓中B220+细胞无显著改变(P＞0.05)。同时，骨髓中前体B细胞的发育也没有显著变化(P ＞0.05)。

注:A:骨髓及脾脏中B220+细胞比例;B:骨髓前体B细胞、未成熟B细胞及成熟B细胞的比例。图3 Apo E基因敲除对骨髓及脾脏B220+细胞的影响Note:A:percent of B220+cells in the bone marrow and spleen;B:percent of pre B，immature B，mature B cells in the bone marrow.Fig.3 Influence of Apo E knockout on the B220+cells in bone marrow and spleen

2.4 Apo E基因敲除小鼠T细胞变化

Apo E基因敲除小鼠外周血T淋巴细胞减少，为了解骨髓及脾脏T淋巴细胞的变化，本研究分析了骨髓、脾脏中CD4+、CD8+细胞。结果发现，脾脏中CD4+细胞比例增多(P＜0.01)，而CD8+细胞比例降低(P＜0.05);骨髓中则未发现显著变化(P＞0.05图4A)。为进一步了解Apo E基因敲除对小鼠T淋巴细胞发育的影响，我们分析了胸腺T淋巴细胞，结果显示，各阶段T淋巴细胞的比例没有显著变化(P＞0.05)图4B)。这说明，Apo E基因敲除对T淋巴细胞发育没有显著影响。

注:A:骨髓及脾脏CD4+、CD8+细胞的比例;B:胸腺中各阶段T细胞的比例;DN:CD4、CD8双阴性细胞，DP:CD4、CD8双阳性细胞。图4 Apo E基因敲除对T淋巴细胞的影响Note:A:percent of CD4+、CD8+cells in the bone marrow and spleen;B:percent of different stages T lymphocytes in the thymus;DN:CD4，CD8 double negative cells，DP:CD4，CD8 double positive cells.Fig.4 Influence of Apo E knockout on T lymphocytes

2.5 Apo E基因敲除对骨髓造血干细胞的影响

为了解Apo E基因敲除对小鼠骨髓造血干细胞的影响，本研究分析了Apo E基因敲除小鼠及同窝野生对照小鼠骨髓造血干细胞的数量，发现Apo E基因敲除小鼠短期造血干细胞(ST－HSC)数量显著增加(P ＜0.05)，长期造血干细胞(LT－HSC)、多潜能造血祖细胞(MPP)及淋系共同祖细胞(CLP)则没有显著变化(P＞0.05)。造血干细胞的功能是否改变，则需进行骨髓移植实验来深入研究。

注:LT:长期造血干细胞，ST:短期造血干细胞，MPP:多潜能造血祖细胞，CLP:淋系共同祖细胞。图5 Apo E基因敲除对骨髓造血干细胞的影响Note:LT:long term HSC，ST:short term HSC，MPP:multipotential progenitors，CLP:common lymphoid progenitor.Fig.5 Influence of Apo E knockout on the hematopoietic stem cell(HSC)

3 讨论

已有研究表明，Apo E基因参与免疫调节作用，Apo E基因敲除小鼠的体液免疫及细胞免疫均发生改变［6］。Apo E基因敲除小鼠在3月龄时已出现脂肪条纹，即动脉粥样硬化早期的损伤性表现［1］。本研究中采用2月龄小鼠作为研究对象喂饲正常小鼠维持饲料，避免了Apo E基因敲除所致疾病对研究目标的影响。本研究发现，Apo E基因敲除后小鼠造血系统B220+、CD4+、CD8+淋巴细胞在外周组织中发生变化，骨髓短期造血干细胞显著增加(P＜0.05)，但是骨髓长期造血干细胞及胸腺T细胞则没有显著变化(P＞0.05)。这说明Apo E基因可能通过免疫调节作用影响B220+、CD4+、CD8+淋巴细胞。Apo E基因对骨髓造血干细胞的自我更新及分化功能是否有影响，尚需应用竞争性骨髓移植、体外克隆形成实验等进一步深入研究。

［1］Reue KL，Quon DH，O'Donnell KA，et al.Cloning and regulation of messenger RNA for mouse apolipoprotein E.The Journal of biological chemistry［J］.1984，259(4):2100－2107.

［2］Ali K，Middleton M，Pure E，et al.Apolipoprotein E suppresses the type I inflammatory response in vivo.Circulation research［J］.2005，97(9):922－927.

［3］Murphy AJ，Akhtari M，Tolani S，et al..ApoE regulates hematopoietic stem cell proliferation，monocytosis，and monocyte accumulation in atherosclerotic lesions in mice.The Journal of clinical investigation［J］.2011，121:4138 －4149.

［4］Kobayashi M，Srour EF.Regulation of murine hematopoietic stem cell quiescence by Dmtf1.Blood［J］.2011，118:6562－6571.

［5］Pietras EM，Warr MR，Passegue E.Cell cycle regulation in hematopoietic stem cells.The Journal of cell biology［J］.2011，195:709－720.

［6］Laskowitz DT，Lee DM，Schmechel D，et al..Altered immune responses in apolipoprotein E－deficient mice.Journal of lipid research［J］.2000，41:613 －620.