16个线粒体DNA SNP复合检测体系的建立

吴 丹 ，聂燕钗 ，曹 禹 ，曹 渊 ，周怀谷

（1.上海市公安局物证鉴定中心 法医物证学现场应用技术公安部重点实验室 上海市现场物证重点实验室，上海 200083；2.复旦大学上海医学院，上海 200032；3.无锡中德美联生物技术有限公司，江苏 无锡 214174）

人类线粒体DNA（mtDNA）是位于细胞核以外的唯一基因组DNA，具有突变率高、遵循母系遗传的特点，与每个体细胞核DNA只有两个拷贝相比，其mtDNA则有成百上千个拷贝，因此，对那些因微量、降解、腐败等原因而造成核DNA分型失败的生物检材进行mtDNA检测分析成为法医物证领域又一重要的技术手段[1]。同时，在母系亲缘关系认定、大型灾难调查、考古研究等方面，mtDNA检测分析也显示出良好的应用前景。目前常规的mtDNA检测方法仍然是对其高变区的直接测序，存在步骤繁琐、费时费力、测序区段有限等缺陷，大大影响了mtDNA在法医物证领域的研究和应用。

本研究利用单核苷酸多态性（SNP）遗传标记分布广泛、遗传稳定、分析片段短、可实现高通量、自动化检测等特点[2]，结合等位基因特异性引物扩增和毛细管电泳检测，开发建立一种16个mtDNA SNP的复合检测体系，对mtDNA进行简便、有效的高通量分型提供一种新的技术手段。

1 材料与方法

1.1 材料

50份汉族无关个体FTA卡血液样本，通风干燥处保存。

1.2 主要仪器与试剂

QIAcube多功能全自动样本制备工作站（德国QIAGEN公司），9700型PCR扩增仪（美国AB公司），7500实时荧光PCR仪（美国AB公司），3130XL遗传分析仪（美国AB公司），Quantifiler DNA定量试剂盒（美国 AB 公司），Wizard®DNA Clean-up System（美国 Promega公司），BigDye Terminator Cycle Sequencing试剂盒（美国AB公司）。

1.3 提取DNA与定量分析

应用QIAcube多功能全自动样本制备工作站提取FTA卡血样DNA，详见使用说明。所得DNA采用Quantifiler DNA定量试剂盒，7500实时荧光PCR仪和SDS v1.2.3软件进行定量分析。

1.4 SNP位点的选择

参考文献[3]并综合考虑高变异率、引物设计、Tm值等诸多因素，最终确定亚洲人群中多态性较高的16个SNP，并以其在mtDNA的序列位置命名，即分别为：152、709、3010、3970、5178、8414、9 bp、9540、10398、10873、12705、13928、14783、15043、16311、16362，其中8281~8289位置碱基序列为CCCCCTCTA，与前面8272~8280的9个碱基形成重复，有时整体缺失，以其序列重复或缺失分别标记为NORM或DEL。

1.5 引物的设计与合成

等位基因特异性引物的设计：针对每个SNP标记，设计3条引物，2条上游等位基因特异性引物序列3′末端分别与二态SNP的两种分型相对应；为限制非特异性延伸，在近其3′端倒数第3或第4位引入一个错配碱基，两条引物在长度上相差4 bp，以示区分；下游为公用引物，并用FAM荧光标记。

测序引物：以300～400bp测序长度为标准，设计14对测序引物，测序片段覆盖全部16个mtDNA SNP标记。

引物设计采用Premier 5.0和Oliog 6.0软件完成，由上海Sangon公司合成。

1.6 复合扩增体系的建立

参照理论Tm值，通过引物浓度配比调整和优化扩增条件等手段，最终确定复合扩增体系为10μL，包括反应混合液 4μL，引物 2μL，C-Taq（5U/μL） 0.2μL，模板DNA 2μL，补纯水至10μL。PCR循环参数为：95℃ 3min；94℃ 1min，58℃ 1min，72℃ 1min，30 个循环；72℃ 20min。

1.7 毛细管电泳分型检测

电泳分析，取PCR产物1μL，mtSNP等位基因分形标准物1μL，分别与AGCU Marker SIZ-500 0.5μL和去离子甲酰胺12 μL混合，95℃变性3 min，冰浴3min，电泳检测。

1.8 测序验证

采用直接测序法进行验证。设计测序引物，随机抽取5个样本，对16个SNP位点序列分别进行DNA测序。对获得的16个SNP位点上的对应碱基，与等位基因特异性引物扩增结果进行比较确认。

2 结 果

2.1 16个mtDNA SNP的复合扩增和分型

采用等位基因特异性引物法，对50份无关个体样本DNA进行复合扩增，9947A作为阳性对照。经毛细管电泳后，50个样本均得到清晰的分型图谱（图1）。

图1 一个体mtDNA SNP复合扩增毛细管电泳图谱

2.2 灵敏度检测

采用本检测体系，样本DNA经倍比稀释后，分别进行扩增检测。结果显示本复合扩增体系中，最低检测量为0.1pg，当模板量在0.5～10pg时能得到较理想的分型图谱。

2.3 测序验证结果

建立的复合检测体系检测结果与直接测序法结果一致（图 2）。

图2 直接测序法图谱（9bp序列重复）

3 讨 论

SNP是由基因组水平上的单个核苷酸变异引起的DNA序列多态性，是迄今为止发现的最能反映群体遗传结构和个体间遗传差异的遗传标记之一。目前已开发的SNP检测方法如利用荧光淬灭效应和实时荧光检测的TaqMan技术，检材适应性广、稳定性好，但成本高、探针设计难度高[4]；基于引物延伸原理的SNPShot微测序方法，结果稳定可靠，现在应用较多，但是仍然需要进行两步扩增反应[5]；高通量的检测方法有等位基因特异性连接技术（SNPlex）[6]、基因芯片技术[7]以及基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱法（matrix-assisted laser desorption/ionization time-offlight mass spectrometry，MALDI-TOFMS）等，这些技术在应用上仍有诸多缺陷，如需要大型专用设备、花费成本过高、耗时长等，不易在一般实验室普及。

相比较之下，本研究建立的片段差异等位基因特异性引物法，操作简便，DNA样本经一步扩增后，直接用于毛细管电泳分型检测，在现有的法医实验室平台上就能完成整个检验过程，耗时短。在特异性引物设计中，在其3′端区域引入一个错配碱基，大大提高了引物延伸的特异性，降低了SNP分析的假阳性率[8]。在本检测体系的16个mtDNA SNP位点上，复合检测体系检出结果与直接测序法结果完全一致，证明该方法分型结果准确可靠。

与直接测序法检测的仅是线粒体高变区不同，本研究引入了13个编码区SNP位点，由于编码区承受的选择压力相对较大，碱基突变率低，分析编码区的多态性位点无疑对法医提高排除率起到积极作用[9]。

在建立的10 μL PCR复合扩增体系中，最低检测量为0.1 pg细胞总DNA，当模板量在0.5～10 pg时能得到较理想结果，与商业化的STR检测试剂盒相比较，由于mtDNA的遗传特性，本检测体系显示出更高的灵敏度。

综上所述，本复合检测体系操作简便、灵敏度高、重复性好、分型准确，可作为替代线粒体测序方法应用于法庭科学检验，同时为法医微量、降解、无核检材的高通量分型提供了新的技术手段。在后续研究中，将进一步扩大检测样本，并通过群体遗传学调查，探讨其在法庭科学领域的应用价值。

[1]Parson W，Bandelt HJ.Extended guidelines for mtDNA typing of population data in forensic science[J].Forensic Sci Int Genet，2007，1（1）：13-19.

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[3]mtDB-Human Mitochondrial Genome Database[DB/OL].（2007-03-01） [2013-06-19].http://www.mtdb.igp.uu.se/.

[4]张素华，李莉，李成涛，等.TaqMan探针技术用于X-SNP位点的分型[J].法医学杂志，2010，26（1）：22-25.

[5]Pastinen T，Kurg A，Metspalu A，et al.Minisequencing：a specific tool for DNA analysis and diagnostics on oligonucleotide arrays[J].Genome Res，1997，7（6）：606-614.

[6]Tobler AR，Short S，Andersen MR，et al.The SNPlex genotyping system：a flexible and scalable platform for SNP genotyping[J].J Biomol Tech，2005，16（4）：398-406.

[7]Bogus M，Sobrino B，Bender K，et al.Rapid microarray-based typing of forensic SNPs[J].International Congress Series，2006，1288：37-39.

[8]卜莹，古卓良，张晓丹，等.四引物PCR扩增反应的单管SNP快速测定法[J].中国生物化学与分子生物学报，2004，20（2）：252-256.

[9]Nilsson M，Andréasson-Jansson H，Ingman M，et al.Evaluation of mitochondrial DNA coding region assays for increased discrimination in forensic analysis[J].Forensic Sci Int Genet，2008，2（1）：1-8.