糖尿病小鼠角膜损害的形态观察△

杨硕 王娟 万幸 贺恒 李斌 刘磊

糖尿病是一种糖代谢异常的全身性疾病，眼部并发症主要包括糖尿病视网膜病变、糖尿病角膜病变、糖尿病性白内障等。糖尿病角膜病变主要表现为角膜上皮的缺损、浅表溃疡以及各种角膜炎等［1-2］，给糖尿病患者造成严重的视觉威胁。目前针对糖尿病角膜病变的主要方法是表面润滑和抗生素治疗，所有这些方法都是在努力创建一种有效的促进角膜损伤愈合的环境。但是这些方法并没有很好地解决糖尿病角膜病变伤口愈合延迟［3］。寻求一种有效的新方法是糖尿病角膜病变研究的核心问题。目前已经发现多种因子与糖尿病角膜病变有密切关系［4-6］。我们在对糖尿病并发眼部疾病的研究过程中，对糖尿病小鼠自然饲养环境下发生的角膜损伤、角膜溃疡进行了形态学观察。旨在了解糖尿病小鼠角膜病变发生发展的过程，对后期进行的糖尿病角膜病变保护因子的研究提供部分形态学依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组 SPF级C57BL/J小鼠30只(华中科技大学实验动物中心)，7～8周龄，雌雄不限。随机分为2组。正常对照组10只，实验组(糖尿病造模组)20只。

1.2 糖尿病小鼠造模 开始造模前C57BL/J小鼠禁食12 h，腹腔连续5 d注射链脲佐菌素(streptozotocin，STZ，美国 Sigma 公司)45 mg·kg－1。最后一次注射后7 d，采用割尾法取血，快速血糖仪(美国强生公司)检测血糖，血糖值大于15.7 mmol·L－1为造模成功［7-8］。每月进行血糖检测，未达标者淘汰出实验组。正常对照组同步处理，检测血糖。实验组共有18只小鼠血糖为高血糖。造模后6个月时4只小鼠存在单眼角膜溃疡，并没有小鼠双眼出现溃疡改变;正常对照组小鼠血糖为 4.0 ～7.0 mmol·L－1。

1.3 角膜取材 正常条件下饲养糖尿病小鼠，分别在造模后3个月、6个月时进行角膜取材。水合氯醛腹腔注射麻醉后，打开胸腔，40 g·L－1多聚甲醛(湖北百奥斯生物)进行心脏灌注，小心取出眼球，置于40 g·L－1多聚甲醛中于4℃固定24 h，石蜡包埋，组织切片，厚度为4 μm，HE染色(HE染液由湖北百奥斯生物配制)。光镜下观察并照相(×20)。

2 结果

正常对照组角膜结构致密，上皮完整(图1)。造模后3个月糖尿病小鼠角膜基质水肿，部分出现疏松改变，角膜上皮较完整。造模后6个月糖尿病小鼠角膜基质结构严重稀疏、水肿、增厚，上皮无明显缺失，其中发生溃疡的角膜，越靠近溃疡区水肿、增厚尤甚，溃疡区角膜上皮缺损。造模后3个月、6个月糖尿病小鼠角膜变化总体为渐进性病变，随病程增加，损害加重(图2-图4)。

Figure 1 The corneal structures arranged closely with complete epithelium in control group图1 正常对照组小鼠角膜结构致密，上皮完整。

.Figure 2 Mild corneal edema with thick stroma appeared in diabeticmice at 3 months after model establishment图2 造模后3个月糖尿病小鼠角膜，可见部分基质水肿，疏松改变。

.Figure 3 Corneal stroma with no ulcer was edema and thicken with disorder structure and complete epithelium in diabeticmice at 6 months after model establishment图3 造模后6个月糖尿病小鼠未发生溃疡的角膜，可见基质增厚、水肿，结构疏松，上皮完整。

.Figure 4 Epithelium around the corneal ulcer was incomplete，and the extent of thickening and edema in ulcer area was higher than that in non-ulcer area significantly in diabeticmice at 6 months after model establishment图4 造模后6个月糖尿病小鼠已发生角膜溃疡，可见基质层水肿、疏松程度明显大于未溃疡眼和3个月糖尿病眼，溃疡区(箭头所指)上皮残缺，基质水肿、疏松明显高于非溃疡区

3 讨论

糖尿病是一种具有严重危害的全身性代谢性疾病，糖尿病角膜病变是一种糖尿病主要的眼表并发症，有47%～64%糖尿病患者会发生角膜损伤性的上皮病变［1］。随着糖尿病患者数量的增多，可以估计，角膜病变将会是摆在众多糖尿病患者面前的一个严重问题。正常角膜上皮细胞通常是作为一种防止眼部感染的屏障，对维持角膜的透明性和完整性有重要作用［3］。糖尿病患者由于自身病理生理异常，代谢紊乱，导致角膜上皮细胞发生异常，出现角膜损伤后愈合缓慢，上皮细胞松散，黏附性降低。在组织形态变化上，角膜上皮和内皮细胞形态改变，基质水肿、增厚［3，9-10］。

目前，关于糖尿病角膜病变的相关研究，已经发现了多种相关的因子与糖尿病角膜病变发生发展过程密切相关。表皮生长因子、胰岛素样生长因子、转化生长因子等在糖尿病角膜病变过程中发挥了一定的作用［4-6］。我们在长期的糖尿病小鼠造模过程中发现，自然环境下发生糖尿病的小鼠会有部分小鼠出现单眼角膜溃疡性改变。我们选取了6个月中发生单眼溃疡糖尿病小鼠，HE染色对比观察溃疡眼和无溃疡眼角膜以及3个月、6个月糖尿病小鼠角膜的形态变化。糖尿病小鼠造模后3个月角膜开始出现基质水肿、增厚，结构松散，角膜刚性结构改变，但上皮大部分完整性尚可，这些改变可能就是糖尿病角膜病变的角膜损害基础;在造模后6个月糖尿病病程中发生角膜溃疡侧角膜结构靠近溃疡区水肿增厚明显，上皮细胞缺损严重。通过正常小鼠和造模后3个月、6个月糖尿病小鼠角膜病变的对比观察，可以明显发现糖尿病小鼠角膜病变的渐进性过程。通过对糖尿病小鼠角膜病变过程和溃疡发生过程的形态学观察，了解糖尿病小鼠病程中角膜的阶段性损害特点，为在后期研究中探讨糖尿病角膜病变保护因子在各个损害病程中作用和变化，提供了部分形态学研究基础。

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