正交试验优选板蓝根多肽的提取工艺Δ

南楠，刘西京，侯安国（1.深圳职业技术学院应用化学与生物技术学院，广东 深圳 518055；.云南中医学院中药学院，昆明 650500）

板蓝根为十字花科植物菘蓝Isatis indigotica Fort.的干燥根，具有清热解毒、凉血利咽之功效[1]。长期以来，研究人员对板蓝根的药效物质基础进行了大量的研究，部分研究认为板蓝根中的游离氨基酸是有效成分[2-3]。2010年版《中国药典》（一部）也对板蓝根中游离氨基酸进行了定性鉴别[4]。笔者在研究中发现，板蓝根中多肽含量较高，经人工胃肠液消化后，通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）法检测发现，板蓝根多肽被降解成小分子多肽，而不是降解成游离氨基酸。整体药理试验也表明，板蓝根多肽有抗流感病毒的作用（另文发表），因此多肽可能为板蓝根的主要物质基础之一，故有必要对板蓝根多肽的提取工艺进行优化。笔者采用正交试验，以新版国家标准凯氏定氮法和2，2′-联喹啉-4，4′-二甲酸二钠盐（BCA）法测定多肽含量，考察提取溶剂、提取时间、溶剂用量对多肽提取的影响，并对这两种测定方法进行比较。

1 材料

1.1 仪器

KDN-04 A型半自动凯氏定氮仪（上海贝特仪电设备厂）；Multiskan spectrum全波长酶标仪（美国Thermo公司）；96孔板（美国康宁公司）；MF1-A10超纯水机（美国Millipore公司）；5180 R高速离心机（德国Eppendorf公司）。

1.2 药材

板蓝根，2011年10月购自甘肃，经湖南省中医研究院刘春海副研究员鉴定为真品。

1.3 试剂

BCA蛋白浓度测定试剂盒（增强型，碧云天生物技术研究所）；其他化学试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 药材的提取

板蓝根药材适当粉碎，过40目筛，称取50 g，按试验安排在常温下进行浸取。用纱布粗滤，以离心半径为8 cm、6000 r/min离心10min，取上清液。平行试验2次。

2.2 板蓝根多肽的含量测定

2.2.1 凯氏定氮法 按国家标准GB 5009.5-2010版凯氏定氮法，精密吸取上清液10ml，依法测定板蓝根浸提液中多肽含量，计算多肽得率（多肽得率＝提取的多肽质量/板蓝根质量×100%）。

2.2.2 BCA法 别精密吸取1、2、4、8、12、20μl的1mg/ml牛血清白蛋白（BSA）标液，加于96孔板中，加水补足20μl，各孔加入200μl BCA工作液，放入酶标仪中，在562nm波长下检测。设定程序如下:振荡30 s，在37Ⅸ下孵育15min。以BSA质量浓度（x）为横坐标，吸光度（y）为纵坐标，进行线性回归，得回归方程为y＝0.010 x+0.146（r＝0.9989）。结果表明，BSA质量浓度在0～90.909μg/ml范围内与吸光度呈良好线性关系。

2.2.3 样品含量测定 精密吸取上清液40μl，加超纯水于1ml量瓶中，吸取20μl加入96孔板中，然后加入200μl BCA工作液，按“2.2.1”、“2.2.2”项下方法测定。

2.3 正交试验优选工艺

根据预试验和笔者经验，选取溶剂种类（A）、提取时间（B）、溶剂用量（C）为考察因素，以多肽得率为评价指标，采用L9（34）正交表进行试验。因素与水平见表1；正交试验结果见表2；方差分析结果见表3。

表1 因素与水平Tab 1 Factors and levels

表2 正交试验结果Tab 2 Results of orthogonal test

表3 方差分析结果Tab 3 Analysis of variance

由表2、表3可知，采用凯氏定氮法测定时，各因素对多肽得率的影响顺序为B＞A＞C，因素A、B对多肽得率的影响有统计学意义（P＜0.05），最佳提取工艺为A1B3C3，即用15倍量超纯水浸泡24h。采用BCA法测定时，各因素对多肽得率的影响顺序为A＞C＞B，其中因素A对多肽得率的影响有统计学意义（P＜0.05），最佳提取条件为A1B1C3，即用15倍量超纯水浸泡6h。考虑到在BCA法中B对结果的影响最小，而在凯氏定氮法中B对结果有较大影响，综合考虑，选取最佳提取工艺为A1B3C3，即用15倍量超纯水浸泡24h。

2.4 工艺验证试验

取5000 g板蓝根药材粗粉，共3份，按上述优选的工艺进行提取，照凯氏定氮法和BCA法测定多肽得率。结果，多肽得率分别为10.58%和6.32%，收率可达70%以上，表明所选工艺稳定、可行，可用于板蓝根中多肽的提取。

3 讨论

蛋白或多肽的测定方法有多种，又各有优缺点[5-9]，如紫外吸收法操作简便快速，但准确度较差；Folin-酚试剂法灵敏度高，对蛋白质和分子质量较小的多肽具有同样的显色反应，但干扰物较多，检出的蛋白含量往往偏高；考马斯亮蓝法灵敏度高，但标准蛋白质选择困难，且对于大量多肽成分存在的溶液不宜用；双缩脲法灵敏度较低，需要的样品量大；凯氏定氮法是测定蛋白或多肽最经典的方法，但本法耗时较长，且含氮的非蛋白质化合物、游离氨基酸等干扰物在样品中普遍存在；BCA法灵敏度高，对于溶液中低含量的多肽也可检出，且干扰物质少。

笔者根据板蓝根的特性，选择凯氏定氮法与BCA法同时测定蛋白质含量，相互验证，以求结果的准确、科学。从试验结果可以看出，两种方法测得的多肽得率相近，凯氏定氮法结果稍偏高，原因是板蓝根浸提液里除了蛋白质和多肽外，还含有很多含氮化合物，如生物碱、核苷类、游离氨基酸类等，换言之，凯氏定氮法的结果是多肽、生物碱、核苷类、游离氨基酸的总和，故测量值偏高。BCA法灵敏度高，干扰少，测定结果相对较准确。两种方法的测定结果差距不大，也说明了在提取液中多肽的含量较高。笔者所在课题组已证实多肽有一定的抗流感病毒作用，因此其在板蓝根“清热解毒”中的作用不应忽视。

一般来说，碱性蛋白或肽采用酸性缓冲溶液提取，酸性蛋白或肽采用碱性缓冲液提取。试验中因不能确定板蓝根中肽的等电点，因此在正交试验设计中采用pH8.0和pH6.0的磷酸盐缓冲液进行提取，测量酸碱两性缓冲溶液和超纯水对总蛋白提取效率的影响。结果显示，无论凯氏定氮法还是BCA法，K2A结果较K3A均偏低，说明偏碱性缓冲液比偏酸性缓冲液提取的多肽得率低，推测板蓝根酸性蛋白或肽含量可能低于碱性蛋白或肽。

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