枸杞类胡萝卜素的分离纯化方法

郭 涛

（丰益上海生物技术研发中心有限公司，上海200137）

枸杞是茄科枸杞属的多分枝灌木植物，是名贵的药材和滋补品，能够养肝明目安神，令人长寿。枸杞的产区主要集中在西北地区，宁夏的枸杞最为著名。有研究发现，枸杞中含有丰富的类胡萝卜素。

类胡萝卜素是一类碳氢化合物——胡萝卜素及它们的氧化衍生物——叶黄素类的总称，这类有机化合物的特点是分子中含有多个不饱和共轭及非共轭双键，其分子量大小、双键数目及类型、含氧原子的数量、官能团类型和分子构型等特征的不同决定了它们理化特性的差异。类胡萝卜素具有亲脂性，几乎不溶于水，易溶于有机溶剂，因此通常采用有机溶剂提取类胡萝卜素。对于高等绿色植物而言，类胡萝卜素往往与另一种脂溶性色素——叶绿素混杂在一起，因而增加了类胡萝卜素提取、分离和纯化的难度。因此枸杞中类胡萝卜素的分离研究是该领域的研究热点之一。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

材料：枸杞，购于农贸市场；

试剂：正己烷、石油醚、丙酮、无水乙醇、石英砂、碳酸钠、BHT、氢氧化钾、甲醇均为AR级（国药集团）；

仪器：高速组织捣碎机，江苏江阴科研器械厂；

紫外-可见分光光度计（UV-120-02），Shimadzu Co.（Japan）；

紫外 -可见光谱扫描分析仪（UV-265FW），ShimadzuCo.（Japan）；

玻璃层析柱（3.5cm×20cm），定制；

层析缸（100mm×200mm，200mm×200mm）。

1.2 实验方法

1.2.1 枸杞色素提取物的制备

有一次，孩子很委屈地找朝敏说：“妈妈，同学们为什么都不理我？爸爸不是说只要树立威风就不愁没有朋友了吗？难道爸爸都是骗人的？”

准确称取200g枸杞，洗净并沥干后混入石英砂、碳酸钠和BHT，在控温多用高速组织捣碎机中用900mL萃取剂分3次搅拌萃取（室温），每次提取时间40min。将提取液抽滤合并转入1500mL分液漏斗中，加入100mL的蒸馏水摇匀，避光静置分层，弃去水相，反复水洗3次去杂，在有机相中加适量无水硫酸钠，避光静置除水1h，过滤，将滤液在40℃以下真空浓缩至干（回收溶剂），即得到枸杞色素提取物，用200mL溶剂溶解即得枸杞色素提取液，充氮密封避光低温保存备用。

1.2.2 枸杞色素提取物的皂化（枸杞总类胡萝卜素的皂化法制备）

取枸杞色素提取液100mL置于250mL棕色试剂瓶中，加入20mL 40%（w/v）氢氧化钾-甲醇溶液，摇匀后充氮置于暗处，在室温下皂化12h，将皂化液转入分液漏斗，弃去水相，将石油醚层多次用蒸馏水洗至中性，再用无水硫酸钠干燥1h，过滤，在40℃以下减压浓缩蒸发至干，即得枸杞色素非皂化物（总类胡萝卜素），用100mL石油醚溶解即得枸杞总类胡萝卜素溶液，置于棕色瓶中，充氮密封，避光低温保存备用。

1.3 分析方法

1.3.1 不同溶剂提取液中总类胡萝卜素含量测定公式

根据经验公式[4]，采用分光光度法测算不同溶剂提取液中总类胡萝卜素含量。用前3种溶剂浸提时直接套用对应的色素含量计算公式，用石油醚或石油醚-丙酮浸提时，把浸提液真空浓缩至干后转溶于同体积的丙酮中，利用类胡萝卜素在丙酮中的经验公式测算相应类胡萝卜素含量。通过比较每种溶剂浸提液中类胡萝卜素含量的多少，即可选择出合适的溶剂。各提取液中总类胡萝卜素含量测定公式分别如下：

在甲醇中：

上式中：D为叶绿素a浓度（μg/mL提取液），E为叶绿素b浓度（μg/mL提取液），F为总类胡萝卜素浓度（μg/mL提取液），G为总类胡萝卜素含量，λ为不同波长的光密度。

1.3.2 枸杞类胡萝卜素提取率的测定

精确称取10.0000g枸杞粉按1.2中试验方法极限浸提，搅拌研磨充分提取色素，定容定量，用分光光度法测定色素浓度，重复3次，取平均值，用于计算总类胡萝卜素含量的提取率。

2 结果与分析

2.1 溶剂对浸提效果的影响

分别选用甲醇、无水乙醇、丙酮、石油醚-丙酮（1:1，v/v）四种溶剂按照1.2.1方法进行浸提，浸提结果见表1。

表1 不同溶剂对浸提效果的影响Tab.1 The effects of different solvents on the extraction

由表1可知，从总类胡萝卜素浓度F来看，浸提效果丙酮>无水乙醇>石油醚-丙酮 (1:1，v/v)>甲醇；从总类胡萝卜素与叶绿素a和b之和的比值（G）来看，石油醚-丙酮（1:1，v/v）>丙酮>无水乙醇>甲醇。因此，综合考虑浸提效果、安全性和成本等因素，选用石油醚-丙酮混合溶剂作为浸提溶剂效果最好。

2.2 枸杞类胡萝卜素提取条件的优化

分别考察浸提时间、浸提次数、料液比及体积比对枸杞类胡萝卜素提取效果的影响，见图1。

如图1（a）所示，浸提时间为2h时，提取液的类胡萝卜素浓度为1.253μg/mL，浸提时间为2.5h时，类胡萝卜素浓度为1.254μg/mL，仅增加0.08个百分点。因此浸提时间控制在2h以内为好。

如图1（b）所示，浸提次数越多，类胡萝卜素提取越完全。浸提3次时类胡萝卜素浓度为0.795μg/mL，与浸提1次相比，浓度增加了32.5%；浸提4次和5次的类胡萝卜素浓度分别为0.807μg/mL和0.811μg/mL，与浸提3次相比，类胡萝卜素浓度增加较小，分别增加1.51%和0.49%，故浸提次数选择3～4次。

图1（c）比较了料液比对浸提效果的影响。当料液比在90g/mL以内时，所提取的类胡萝卜素浓度随料液比值的增大而明显增加，当料液比为120g/mL时的类胡萝卜素浓度为1.164μg/mL，超过120g/mL以后，类胡萝卜素浓度仅增加0.09%。因此，料液比应不超过120g/mL。

图1（d）比较了石油醚-丙酮混合溶剂的不同比例对浸提效果的影响。图中的横坐标1、2、3、4、5分别代表石油醚-丙酮体积比 3:1、2:1、1:1、1:2、1:3。可见随着丙酮在混合溶剂中所占比例的增加，溶剂极性也逐步增强，当石油醚与丙酮的体积比小于1:1时，溶剂极性较强，反之则较弱。随着溶剂极性的增强，类胡萝卜素的浓度逐渐增大，当石油醚与丙酮的比例为1:3时，浓度达到最大。

图1 浸提条件对枸杞类胡萝卜素浸提效果的影响Fig.1 Effecton carotenoidsextraction from Lycium Chinensis byextractingcondition

按照1.3.2方法测得枸杞总类胡萝卜素的含量为552.57mg/kg，用2.2最佳浸提条件下其总类胡萝卜素的提取率可达95.5%。

2.3 枸杞类胡萝卜素柱层析分离和纯化条件

2.3.1 吸附剂选择

以枸杞色素提取物和不皂化物（总类胡萝卜素）为材料，洗脱剂选择正己烷-丙酮=90:10（v/v），吸附剂尝试为硅胶、氧化铝、聚酰胺、碳酸镁、氧化镁、碳酸镁-硅藻土=1:1（w/w）、氧化镁-硅藻土=1:1（w/w）、氧化镁-硅藻土=1:2（w/w）、氧化镁-硅藻土=1:3（w/w），不同吸附剂对洗脱的影响见表2。

表2 不同吸附剂对洗脱的影响Tab.2 The effect of different elution adsorbent

表2显示，将氧化镁与硅藻土按不同比例混合装柱的分离效果明显好于其它，并且随着硅藻土的增加，洗脱速度依次加快，综合比较分离速度、分离效果、柱床稳定性及可再生性，以氧化镁-硅藻土=1:2（w/w）的组合为最佳吸附剂。

2.3.2 枸杞类胡萝卜素薄层层析分离和纯化条件

以2.3.1分离得到的类胡萝卜素及不皂化物为材料，用硅胶G薄层层析对它做进一步的分离和纯化。吸附剂选择为氧化镁-硅藻土=1:2（w/w），薄层展开剂为石油醚-丙酮=17:4。

图2可知，枸杞色素主要类型有黄色素、红色素和绿色素，皂化后剩下黄色素和红色素，绿色素消失由图4可知其紫外可见光谱都呈相似的“三指状”（three-peak spectrum）。在可见光区有吸收峰表明分子中有共轭双键，光谱区在350～550nm之间，最高峰和次高峰分别为445.0nm及472.4nm，这是类胡萝卜素的典型图谱。因此，展开剂选用石油醚-丙酮=17:4（v/v），对枸杞色素提取液、枸杞总类胡萝卜素样品的分离效果很好，并且经多次试验验证，这种分离纯化方法重复性好、稳定可靠、可满足精细分离和样品制备的需要。

图2 枸杞类胡萝卜素的薄层层析分离纯化效果溶剂:石油醚（60～90℃）Fig.2 Separation and purification of separation and purification of chinensiscarotenoids from Lycium chinensis by thin-layer chromatography(TLC)

图3 枸杞色素提取物的紫外可见光谱溶剂:石油醚（60～90℃）Fig.3 UV-VIS spectrum of pigment extracts of Lycium chinensis

图4 枸杞色素非皂化物的紫外可见光谱溶剂:石油醚（60～90℃）Fig.4 UV-VIS spectrum of unsaponifiable matter of pigment extracts of Lycium chinensis

3 结论

1）对枸杞类胡萝卜素的浸提条件进行了研究。得到的最佳参数是：浸提液为石油醚-丙酮（1:3，v/v）混合溶剂，料液比为90（g/mL），在常温下分3次浸提，总浸提时间为1.5h。枸杞总类胡萝卜素的含量为552.57mg/kg，在此条件下其总类胡萝卜素的提取率可达95.5%。

2）对分离效果的研究。洗脱剂选择正己烷-丙酮=90:10（v/v），吸附剂选择为氧化镁-硅藻土=1:2（w/w）；薄层展开剂选择为石油醚-丙酮=17:4，此条件下对枸杞色素提取液、枸杞总类胡萝卜素样品有很好的分离效果。

[1]吉宏武,施兆鹏.HPLC分离测定红心薯中类胡萝卜素[J].无锡轻工大学学报,2001,20(3):299-301.

[2]王强,韩雅珊,广田才之,等.食品中多种类胡萝卜素的测定（HPLC法）[J].营养学报，1997，19（2）：212-215.

[3]刘大川,王静.紫（白）苏叶类胡萝卜素提取工艺的研究[J].中国粮油学报,2002,17(1):54-58.

[4]李赫,陈敏,马文平,等.不同成熟期枸杞中类胡萝卜素含量的变化规律[J].中国农业科学,2006,39(3):599-605.

[5]王业勤,李勤生.天然类胡萝卜素-研究进展、生产、应用[M].北京:中国医药科技出版社,1997.