纯阳正气胶囊抑制幽门螺杆菌作用研究

冯青，刘伟，苏楠，吴新荣

(1.华南理工大学轻工与食品学院，广州 510640;2.广州军区广州总医院药学部，广州 510010;3.南方医科大学药学院，广州 510515;4.广州中医药大学中药学院，广州 510405)

纯阳正气胶囊抑制幽门螺杆菌作用研究

冯青1，2，刘伟2，3，苏楠2，4，吴新荣2

(1.华南理工大学轻工与食品学院，广州 510640;2.广州军区广州总医院药学部，广州 510010;3.南方医科大学药学院，广州 510515;4.广州中医药大学中药学院，广州 510405)

目的 考察纯阳正气胶囊对幽门螺杆菌(Hp)的体外抑制作用。方法采用纸片扩散法、微量倍比稀释法观察纯阳正气胶囊对Hp的抑菌圈与吸光度(A)值。结果纸片扩散法实验中,Hp对浓度≥0.05 g·mL-1纯阳正气胶囊药液为中敏;通过测定菌液的A值,确定0.4,0.2,0.1 g·mL-1(按生药计)纯阳正气胶囊药液的抑菌率分别为76.01%, 69.83%,48.52%,与阴性对照比较,均差异有统计学意义。结论纯阳正气胶囊对Hp具有一定的体外抑制作用。

纯阳正气胶囊；幽门螺杆菌；抑菌作用,体外

幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)是一种微需氧性革兰阴性杆菌,传染性强,感染后可寄生于人胃和十二指肠黏膜,引发消化性溃疡、非溃疡性消化不良[1],也是引发胃癌和低度胃黏膜相关淋巴组织淋巴瘤的重要致病因素[2]。目前,广泛采用以抗菌药物、质子泵抑制药、铝酸铋制剂为主的三联或四联方法[3],但在治疗过程中,广泛使用抗菌药物,Hp会出现耐药性[4]。耐药菌株的出现已成为药物根除Hp成功率下降的主要因素。文献报道,一些单味中药[5],如苍术[6]、陈皮[7]、丁香[8],及中药复方如除幽汤[9](处方由茯苓、白术、法半夏等组成)、胃喜康煎剂[10](由茯苓、丹参等组成)在一定浓度下具有抑制Hp作用。纯阳正气胶囊由广藿香、半夏、土木香、陈皮、丁香、肉桂、苍术、白术、茯苓、朱砂、硼砂等组成,笔者在本实验中对该药进行体外抑制Hp作用研究。

1 材料与方法

1.1 菌株及培养鉴定 Hp(ATCC43504)购自广州微生物研究所。培养基为含5%的脱纤维羊血的哥伦比亚琼脂,在37℃微需氧环境[85%氮气(N2)、10%二氧化碳(CO2)、5%氧气(O2)培养72 h。菌株经菌落特征、菌体形态、生理生化鉴定为Hp菌株。

1.2 药物 纯阳正气胶囊(合肥立方制药股份有限公司,批号:110201)。阳性对照药阿莫西林(石药集团中诺药业有限公司,规格:按C16H19N3O5S计,每粒0.25 g,批号:160110215)。

1.3 试剂及设备 哥伦比亚琼脂培养基、脑-心浸出液肉汤(brain heart infusion broth,BHI,广东环凯微生物科技有限公司),无菌脱纤维羊血,微需氧产气袋(英国OXOID公司),CW-CJ-2F净化工作台(苏净集团苏州安泰空气技术有限公司),LRH-250A生化培养箱(广东医疗器械厂),ZHWY-200B恒温培养振荡器,酶标仪(MULTISKAN GO Thermo scientific)。

1.4 药液的制备 纯阳正气胶囊去胶囊后用钴60(60Co)消毒,采用半仿生法原理溶解药物,模拟口服给药及药物经胃肠道转运原理,用pH为3.0的纯化水将药物粉末超声溶解,过滤,未溶解药物粉末用pH 7.0的纯化水进行超声溶解,过滤,每次超声时间为35 min,混合两次滤液,调pH为中性。药液浓度为0.4 g·mL-1(按生药计)。将中性药液以培养液倍比稀释(1∶2,1∶4,1∶8,1∶16,1∶32),备用。阿莫西林采取相同方法处理。

1.5 菌悬液的制备 将接种3 d的Hp用无菌0.9%氯化钠溶液洗下,加入脑心浸出液肉汤配成脑心浸液Hp菌悬液,用标准比浊管进行比浊,校正菌液浓度,使菌液浓度达到1×108CFU·mL-1。

1.6 抑菌实验

1.6.1 纸片扩散法 取Hp悬液100 μL,均匀涂于含5%脱纤维羊血的哥伦比亚琼脂培养基平板上,于37℃微需氧环境(85%N2、10%CO2、5%O2)平衡0.5 h。取直径6 mm圆形灭菌滤纸片,浸入梯度浓度药液、阿莫西林药液、阴性对照溶液(灭菌的中性纯化水),1 h,取滤纸片3张,平贴于涂布菌株的平皿内,置于37℃微需氧环境内培养72 h,观察结果,取出,计算抑菌圈(包括纸片)直径。取3张抑菌圈的平均直径。阳性对照阿莫西林浓度分别为0.125, 0.062 5 g·mL-1。判断标准:抑菌圈直径＞20 mm为极敏,抑菌圈直径15～20 mm为高敏,抑菌圈直径10～15 mm为中敏,抑菌圈直径＜10 mm为低敏,无抑菌圈为不敏感。

1.6.2 微量倍比稀释法 取96孔微量培养板,于1～5孔加入倍比稀释的梯度浓度药液,每孔的药量均为100 μL,将配好的菌悬液用液体培养基稀释1 000倍,使Hp菌悬液的浓度为1×105CFU·mL-1。用微量移液器将菌悬液100 μL加入对应区的各实验孔中,将孔内液体充分混匀,此时各孔含液200 μL,药物浓度为0.2,0.1,0.05,0.025,0.012 5 g·mL-1。阴性对照孔加入液体培养基200 μL,阳性对照孔加入菌悬液100 μL和含阳性对照药液体培养基100 μL,根据“1.6.1”项结果,纯阳正气胶囊内容物药液浓度在0.012 5 g·mL-1时,对Hp无抑菌性,故在此方法中,阳性对照药选择对菌株有高敏性的0.125 g·mL-1的药液。将接种好的微量培养板置于37℃微需氧环境中培养72 h。以上实验过程重复3次。酶标仪测定吸光度(A)值:上述微量培养板于37℃培养箱培养72 h后,用酶标仪于540 nm处测各孔A值,与阳性对照孔对比,计算各浓度药液对Hp的抑菌率。

1.7 统计学方法 抑菌率计算公式:抑菌率(%)= (阳性对照A值-实验A值)/(阳性对照A值-阴性对照A值)×100%。实验数据均以均数±标准差(±s)表示,并采用SPSS 17.0版统计软件进行单因素方差分析,P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 纸片扩散法抑菌结果 结果表明,幽门螺杆菌对0.05 g·mL-1药液有一定的敏感性。

表1 不同浓度药液的抑菌圈直径及敏感性Tab.1 Inhibition zone diameters and sensitivities of different concentrations of solutions mm,±s,n=3

表1 不同浓度药液的抑菌圈直径及敏感性Tab.1 Inhibition zone diameters and sensitivities of different concentrations of solutions mm,±s,n=3

组别浓度/(g·mL-1)抑菌圈/mm 敏感性纯阳正气胶囊药液0.213.1±0.265中敏0.111.5±0.153中敏0.0510.5±0.115中敏0.0257.8±0.153低敏0.012 50.0±0.0不敏感阴性对照0.00.0±0.0不敏感阳性对照0.12518.7±0.265高敏0.062 510.9±0.187中敏

2.2 微量倍比稀释法抑菌结果 结果表明药液浓度>0.1 g·mL-1具有体外抑制Hp的作用,见表2。与阴性对照相比,浓度≥0.1 g·mL-1的药液(按生药计)对Hp有抑制作用。

表2 Hp在不同浓度药液中生长72 h后的A值及抑菌率Tab.2 A values and bacteriostasis rate on H.pylori 72 hours after growth in different concentration of solutions ±s,n=3

表2 Hp在不同浓度药液中生长72 h后的A值及抑菌率Tab.2 A values and bacteriostasis rate on H.pylori 72 hours after growth in different concentration of solutions ±s,n=3

与阴性对照组比较,*1P＜0.05Compared with negative control group,*1P＜0.05

组别浓度/(g·mL-1)A值抑菌率/%纯阳正气胶囊药液0.40.482 4±0.011 1*176.01 0.20.517 8±0.006 0*169.83 0.10.639 9±0.011 7*148.52 0.050.871 4±0.018 28.10 0.0250.911 5±0.001 81.09阴性对照0.00.917 8±0.001 80.00阳性对照0.1250.341 7±0.010 2100.00

3 讨论

本实验结果表明,纯阳正气胶囊对Hp标准菌株有一定的抑制作用,其药液浓度与抑菌效果呈正相关, 0.2 g·mL-1药液对Hp为中敏,0.012 5 g·mL-1药液对Hp无抑制作用。对菌株有中敏感性的药液,与阴性对照比较,0.4,0.2,0.1 g·mL-1药液(按生药计)对实验菌有抑制作用,结果表明,微量倍比稀释法可更准确判断不同浓度药液的抑菌率,因此纯阳正气胶囊在临床应用中要注意有效药物浓度。

组成纯阳正气胶囊的16味中药中,广藿香和半夏两药为主药。广藿香归脾胃、肺经,辛者散邪行气行湿,温者祛寒。体外实验证明,广藿香中的藿香酮对大肠杆菌有抑制作用。半夏归脾、胃、肺经,以燥湿化痰、降逆止呕为特点,是止吐的良药,尤其适宜于寒湿所致的呕吐,纯阳正气胶囊治疗急性胃肠炎具有疗效好、奏效快的特点,不增加胃肠负担,无毒副作用[11]。目前Hp对抗生素的耐药性增加,中药治疗中感染副作用小,不产生耐药性,使该复方胶囊具有开发用于治疗Hp感染的前景。有文献报道,苍术[6]、陈皮[7]、丁香[8]等具有体外抑菌作用,而本实验所用复方中含有此类具有抑菌作用的中药成分。

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DOI 10.3870/yydb.2014.03.013

Inhibition Effect of Chunyang Zhengqi Capsule Against Helicobacter Pylori in vitro

FENG Qing1,2,LIU Wei2,3,SU Nan2,4,WU Xin-rong2
(1.School of Light Industry and Food Sciences,South China University of Technology,Guangzhou 510640,China;2.Department of Pharmacy,General Hospital of Guangzhou Military Command of PLA,Guangzhou 510010,China;3.School of Pharmaceutical Sciences,Southern Medical University,Guangzhou 510515,China;4.School of Chinese Materia Medica,Guangzhou University of Chinese Medicine,Guangzhou 510405,China)

Objective To evaluate the antibacterial effect of herbal compoundchunyang zhengqicapsules againstHelicabacter pylori in vitro.MethodsThe inhibition zone andAvalue were measured by the agar disk method and trace multiple proportion dilution for evaluating the bacteriostasis ofchunyang zhengqicapsules.ResultsIt was showed thatHelicabacter pyloriwas moderately sensitive tochunyang zhengqisolution at concentrations above 0.05 g·mL-1.By measuring theAvalue of the bacteria solution,the bacterialstasis ofchunyang zhengqicapsule at 0.4,0.2,0.1 g·mL-1was 76.01%,69.83%,48.52%,respectively,which was significantly different from the negative control(P＜0.05).ConclusionThe herbal compoundchunyang zhengqicapsule has a certain inhibitory effect against H.pylori.

Chunyang zhengqicapsule;Helicobacter pylori;Bacteriostasis,in vitro

R286;R965

A

1004-0781(2014)03-0322-03

2013-05-15

2013-06-20

冯青(1989-),女,河北邯郸人,在读硕士,研究方向:药物筛选及机制研究。电话:020-88654670,E-mail：fqyouxue@163.com。

吴新荣,女,主任药师,博士生导师。电话: 020-88653476,E-mail：gzwxrong@yahoo.com。