2，4-二氨基甲苯及其同分异构体含量的快速测定

王成云，樊秀荣，黄明珠，阮营花，沈雅蕾，谢堂堂

深圳出入境检验检疫局工业品检测技术中心，深圳 518067

2，4-二氨基甲苯及其同分异构体含量的快速测定

王成云，樊秀荣，黄明珠，阮营花，沈雅蕾，谢堂堂

深圳出入境检验检疫局工业品检测技术中心，深圳 518067

建立一种超高效液相色谱方法，可对2，4-二氨基甲苯及其同分异构体进行快速分离鉴定，排除了非禁用的同分异构体对禁用初级芳香胺2，4-二氨基甲苯测定的干扰.该方法的加标回收率为63.67% ～78.90%，精密度实验相对标准偏差值均小于5%.在信噪比(S/N)=3的条件下，2，3-二氨基甲苯、2，4-二氨基甲苯、2，6-二氨基甲苯和3，4-二氨基甲苯的检出限分别为1.0、0.5、0.5和1.0 μg/mL.该方法简便快速，分析耗时不到5 min，定性可靠、定量准确，可有效解决禁用偶氮染料检测中2，4-二氨基甲苯的假阳性问题.

分析化学;超高效液相色谱法;2，4-二氨基甲苯;禁用偶氮染料;同分异构体;快速测定;纺织品;假阳性;干扰

目前世界各国生产的纺织染料已超过7 000种，其中常用的超过2 000种.按化学结构划分，这些染料主要分为偶氮染料、硝基染料、硫化染料和蒽醌染料.偶氮染料分子结构中含有偶氮基，且与其连接部分至少含有一个芳香族结构.偶氮染料制作简便、色谱齐全、色光良好、染色牢固，几乎能染所有纤维，是纺织印染工艺中应用最广泛的一类合成染料.但部分初级芳香胺已被证明对人体健康和环境安全有害，如2，4-二氨基甲苯被证明具有致突变和致癌性［1-2］.1994年7月15日，德国率先颁布禁令，禁止在消费品中使用部分偶氮染料，随后各国纷纷立法，限制在纺织品中使用部分偶氮染料［3-4］.欧盟《化学品的注册、评估、授权和限制》(Regulation Concerning the Registration，Evaluation，Authorization and Restriction of Chemicals，REACH)法规正式实施后，产自中国的纺织品被召回次数占纺织品总召回数的一半［5］，而被召回的最主要原因是被检出含有禁用的偶氮染料超标［6-7］.偶氮结构是偶氮染料中形成基础颜色的物质，但并非所有偶氮染料均被禁用.目前，被禁用的偶氮染料共有24种，部分禁用偶氮染料有同分异构体，但其同分异构体并未被禁用［8］.同分异构体的相对分子质量相同、极性相差不大、沸点相近、质谱的特征离子相同.在禁用偶氮染料的检测中，这些同分异构体对禁用偶氮染料的检测造成严重干扰［9］.纺织品中2，4-二氨基甲苯的检出率较高［10］，其常见的同分异构体有2，3-二氨基甲苯、2，6-二氨基甲苯和 3，4-二氨基甲苯，这3个同分异构体均未被禁用.目前通常采用GC/MS单柱法来测定禁用偶氮染料，但该法不能将2，4-二氨基甲苯与其同分异构体区分开来，甚至会产生假阳性结果.改用不同极性的色谱柱可以将部分同分异构体分离，但2，4-二氨基甲苯与2，6-二氨基甲苯的分离效果仍不理想［11］.也可以用三氟乙酸酐衍生化处理后再进行测试［12］，但该方法尚不成熟，难以满足检测要求.对于GC/MS检出结果为阳性的样品，通常需要使用第2种检测手段进行确证，而液相色谱法则是最常用的确证手段［13-19］.超高效液相色谱 (ultra-high performance liquid chromatography，UPLC)分离能力强、分离速度快［17-20］，本研究采用UPLC法对2，4-二氨基甲苯及其同分异构体进行了快速分离鉴定，分析耗时仅5 min.

1实验

1.1 仪器与试剂

本实验采用LC-20AD XR型高效液相色谱仪(日本岛津公司);Heidolph 4003型旋转蒸发仪(德国Heidolph公司);UV 2550型紫外-可见分光光度计 (日本岛津公司);氮吹仪 (北京康林科技有限公司);Milli-Q纯水仪 (Millipore公司);0.45 μm滤膜 (德国Membrane公司).

2，3-二氨基甲苯、2，4-二氨基甲苯、2，6-二氨基甲苯和3，4-二氨基甲苯标准品纯度均为99.5%，均由德国Dr.Ehrenstorefer GmbH公司提供;乙腈(色谱纯)由Merck公司提供.

缓冲溶液为0.02 mol/L磷酸二氢铵-磷酸氢二钠溶液.取0.575 g磷酸二氢铵和0.7 g磷酸氢二钠溶液，溶于1 000 mL二次蒸馏水中，用磷酸调节pH=4.50.

1.2 标准溶液的配制

准确称取2，3-二氨基甲苯、2，4-二氨基甲苯、2，6-二氨基甲苯和3，4-二氨基甲苯标准品，用乙腈溶解，配制标准溶液储备液.移取适量体积的各标准溶液储备液，置于25 mL容量瓶中，用乙腈定容，配制成混合标准溶液储备液，该溶液中2，3-二氨基甲苯、2，4-二氨基甲苯、2，6-二氨基甲苯和3，4-二氨基甲苯的质量浓度分别为88.8、82.4、87.2和80.0 μg/mL.使用时，用乙腈逐级稀释至所需浓度.

1.3 样品前处理

按 GB/T 17592—2011［15］或 EN 14362—1 ∶2012［16］处理样品.

1.4 色谱条件

色谱柱为岛津Shim-pack XR-ODS色谱柱 (100 mm ×3.0 mm ×2.2 μm)，柱温为 50 ℃;进样量为1.0 μL，流速为 0.8 mL/min，流动相为乙腈(A)-缓冲溶液 (B).采用梯度淋洗方式，开始时，A的体积分数是10%，B的体积分数是90%，保持1 min;淋洗5 min时，A的体积分数是14%，B的体积分数是 86%;2，3-二氨基甲苯、2，4-二氨基甲苯、2，6-二氨基甲苯和3，4-二氨基甲苯的检测波长分别为233、234、232和232 nm.

2 结果与讨论

2.1 检测波长的选择

2，4-二氨基甲苯及其同分异构体含有相同的官能团，但官能团的位置各不相同，因此其紫外-可见吸收光谱稍有差异，图1为4种化合物的紫外-可见光吸收光谱图，在220～320 nm区间内，2，3-二氨基甲苯、2，4-二氨基甲苯、2，6-二氨基甲苯和3，4-二氨基甲苯均出现2个吸收峰，最大吸收峰波长分别为233、234、232和232 nm，另一强吸收峰波长分别为284、288、285和288 nm.对于2，3-二氨基甲苯、2，4-二氨基甲苯、2，6-二氨基甲苯、3，4-二氨基甲苯，分别选择233、234、232和232 nm为其检测波长.从图1可以看出，在质量浓度相近的条件下，2，6-二氨基甲苯的光密度明显大于其他3个同分异构体.

图1 紫外-可见吸收光谱Fig.1 UV-visible spectra

2.2 流动相的优化

2，3-二氨基甲苯、2，4-二氨基甲苯、2，6-二氨基甲苯和3，4-二氨基甲苯均易溶于甲醇、乙腈等有机溶剂，适于采用反相色谱进行分离测定.高效液相色谱 (high performance liquid chromatography，HPLC)法测定禁用偶氮染料时，通常采用甲醇-缓冲溶液体系作为流动相，缓冲溶液为pH=6.9的NH4HPO4-NaH2PO4.在此条件下，改变梯度淋洗参数，观察分离效果，发现4个同分异构体的出峰次序为 3，4-二氨基甲苯、2，4-二氨基甲苯、2，3-二氨基甲苯和2，6-二氨基甲苯.其中，3，4-二氨基甲苯、2，4-二氨基甲苯之间能较好分离，但2，3-二氨基甲苯则与2，6-二氨基甲苯完全重叠.

洗脱液的极性直接影响反相HPLC的分离效果［17-18］，改变流动相中缓冲溶液的pH值，观察流动相极性对分离效果的影响.研究发现，4个同分异构体的出峰次序发生改变，为2，6-二氨基甲苯、2，4-二氨基甲苯、3，4-二氨基甲苯和 2，3-二氨基甲苯.随着缓冲溶液pH值的下降，2，3-二氨基甲苯则与2，6-二氨基甲苯逐渐分离开来.当pH=5.0时，2，3-二氨基甲苯则与2，6-二氨基甲苯间的分离度达到1.04;当pH=4.5时，两者已完全分离;当pH值继续下降时，分离度进一步加大.随着pH值的降低，各组分的保留时间逐渐缩短，这在一定程度上不利于各组分之间的分离.综合考虑，当pH=4.5时，各组分能完全分离，且各组分的保留时间也比较合适，分离效果最佳.

在缓冲溶液pH=4.5的条件下，改变流动相的起始组分和淋洗梯度，观察分离效果的变化.结果发现，当采用1.4节中的梯度淋洗条件时，分离效果最佳，各色谱峰峰形尖锐，对称性好，4个色谱峰之间完全分离，其分离度分别为R(2，4-二氨基甲苯与 2，6-二氨基甲苯)=2.9，R(3，4-二氨基甲苯与 2，4-二氨基甲苯)=15.1，R(2，3-二氨基甲苯与3，4-二氨基甲苯)=4.5.

流动速度也对分离效果有影响.若维持其他条件不变，改变流动速度，观察流动速度对分离效果的影响，结果发现，流动速度减小时，各色谱峰的保留时间增大，色谱峰的峰形展宽，峰形对称性下降，各色谱峰之间的分离度增大;流动速度增大时，各色谱峰的保留时间减小，色谱峰对称性增加，峰形变窄，各色谱峰之间的分离度减小.同时，色谱柱的柱压明显增加.综合考虑，最终确定的流动速度为0.8 mL/min.

保持其他条件不变，改变色谱柱温度，观察分离效果的变化，结果发现，随着色谱柱温的升高，柱压迅速下降，分离效果变差.由于流动相为乙腈–缓冲溶液体系，导致色谱柱压较高，必须维持一定的色谱柱温，才能确保色谱柱压不超出其最大允许值.综合考虑，最终确定柱温为50℃.

在上述条件下，对2，3-二氨基甲苯、2，4-二氨基甲苯、2，6-二氨基甲苯和3，4-二氨基甲苯混合标准溶液进行分离，结果如图2所示.图2中各色谱峰峰形对称性好，谱峰尖锐，各色谱峰之间分离完全.在质量浓度相近的条件下，2，6-二氨基甲苯的色谱峰明显大于其他3个同分异构体，这一结果与图1一致.

2.3 方法的线性关系和检出限

图2 混标的HPLC图Fig.2 HPLC chromatogram of mixed standards

在本方法确定的条件下，对于不同质量浓度混标溶液进行测定，结果表明，在一定质量浓度(ρ)范围内，其色谱峰面积(A)与ρ之间存在良好的线性关系.表1给出了各组分的线性关系及检测波长.以不含上述4个组分的白衬布为空白样品，添加不同质量浓度的混标液进行测定，确定方法的检出限.在信噪比(S/N)=3时，得到各组分的检出限，见表1.

2.4 精密度和回收率实验

以不含上述物质的白色棉衬布为空白样品，分别添加3个不同浓度水平的混合标准溶液，测定方法的回收率，结果见表2.在3个添加水平下，2，3-二氨基甲苯、2，4-二氨基甲苯、2，6-二氨基甲苯、3，4-二 氨 基 甲 苯 的 回 收 率 分 别 为 64.98% ～78.90%、65.06% ～ 81.57%、63.67% ～ 76.43%和68.74% ～78.55%，均满足相关标准对回收率的要求.各添加水平下，各组分的回收率实验相对标准偏差 (relative standard deviation，RSD)值均小于5%.

表1 线性关系及检出限Table 1 Linear relationship and detected limits

表2 精密度与回收率*Table 2 Precision and recovery

2.5 实际样品测试

采用GC/MS单柱法对纺织品进行测定，筛选出可能含有2，4-二氨基甲苯的样品，然后利用本研究建立的方法进行确认.若样品在与标准品相同的保留时间处出现吸收峰，且其紫外-可见吸收光谱与标准品的紫外-可见吸收光谱一致，则确认为阳性样品;若保留时间内虽然相同，但其紫外-可见吸收光谱不一致，则确认为假阳性样品.在87个样品中，11个样品检出2，4-二氨基甲苯，4个样品检出2，3-二氨基甲苯，其余样品中均未检出2，4-二氨基甲苯及其同分异构体.图3给出了2个典型样品的HPLC图，其中1#样品为涤棉经编针织提花染色布，该样品中检出2，4-二氨基甲苯，质量分数为42.2 mg/kg;2#样品为平纹机织染色棉布，该样品中检出2，3-二氨基甲苯，质量分数为18.5 mg/kg.图2中，2#样品在1.42 min处出现一个吸收峰，该吸收峰与2，4-二氨基甲苯保留时间一致，但其紫外-可见吸收光谱与2，4-二氨基甲苯不同，从而判定该吸收峰不是2，4-二氨基甲苯.

图3 实际样品的HPLC图Fig.3 HPLC chromatograms of real samples

结 语

为排除非禁用的同分异构体对禁用芳香胺2，4-二氨基甲苯测定的干扰，本研究建立了一种超高效液相色谱方法，可对2，4-二氨基甲苯及其同分异构体进行快速分离鉴定.该方法采用shim-pack XR-ODS柱 (100 mm ×3.0 mm ×2.2 μm)色谱柱，柱温为50℃，流速为0.8 mL/min，流动相为乙腈(A)-缓冲溶液(pH=4.5)(B)，采用梯度淋洗方式，开始时，流动相A的体积分数为10%，B的体积分数为90%，保持1.0 min;5.0 min时，线性递变为A的体积分数为14%，B的体积分数为86%，2，3-二氨基甲苯、2，4-二氨基甲苯、2，6-二氨基甲苯和3，4-二氨基甲苯的检测波长分别为233、234、232和232 nm.该方法定性可靠，定量准确，分析耗时仅需5 min，有效地解决了纺织品禁用偶氮染检测中2，4-二氨基甲苯测试的假阳性问题.

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2014-02-07;

2014-04-08

Rapid determination of 2，4-diaminotoluene and its isomers

Wang Chengyun†，Fan Xiurong，Huang Mingzhu，Ruan Yinghua，Shen Yalei，and Xie Tangtang

The Testing and Technology Center for Industrial Products，Shenzhen Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Shenzhen 518067，P.R.China

In order to avoid the interference of the non-banned isomers on the determination of 2，4-diaminotoluene，an effective ultra-high performance liquid chromatography(UPLC)method was established.The spiked recoveries ranged from 63.67%to 78.90%while the relative standard deviation(RSD)of precision experiments all registered less than 5%.Under the condition of signal to noise S/N=3，the detection limit was 1.0，0.5，0.5 and 1.0 g/mL for 2，3-diaminotoluene，2，4-diaminotoluene，2，6-diaminotoluene and 3，4-diaminotoluene，respectively.Tests show that the proposed method is simple and rapid，only needing less than 5 minutes for the analysis procedure.This method is therefore reliable and accurate in quantity，and it also solves effectively the false positive problem in the analysis of 2，4-diaminotoluene.

analytical chemistry;ultra-high performance liquid chromatography;2，4-diaminotoluene;banned azo dyes;isomer;rapid determination;textile;false positive;interference

O 657.7+2

A

10.3724/SP.J.1249.2014.03252

Foundation:AQSIQ Science and Technology Plan(2012IK119)

†

Professor Wang Chengyun.E-mail:wangchengyun2009@126.com

:Wang Chengyun，Fan Xiurong，Huang Mingzhu，et al.Rapid determination of 2，4-diaminotoluene and its isomers ［J］.Journal of Shenzhen University Science and Engineering，2014，31(3):252-257.(in Chinese)

国家质检总局科技计划资助项目 (2011IK119)

王成云 (1969—)，男 (汉族)，湖南省新化县人，深圳出入境检验检疫局工业品检测技术中心研究员、博士.E-mail:wangchengyun2009@126.com

引 文:王成云，樊秀荣，黄明珠，等.2，4-二氨基甲苯及其同分异构体含量的快速测定 ［J］.深圳大学学报理工版，2014，31(3):252-257.

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