MMP-8及TIMP-1在慢性牙周炎患者龈沟液中的表达和意义

王丽琴，冯 坤，孙 利

(上海市口腔病防治院口腔内科，上海 200031)

牙周病是口腔两大类主要疾病之一，在世界范围内均有较高的患病率。目前，牙周疾病是引起牙周组织缺损最终导致牙齿缺失的最常见病因。因此，对牙周病病因、发展以及临床治疗的研究具有相当现实的意义。基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)是高度保守的依赖于锌离子的内切蛋白水解酶家族，可降解基底膜和细胞外基质的大多数蛋白质。MMPs分为5大类:胶原酶、明胶酶、基质降解素、膜型MMPs以及结构和功能比较特殊的MMPS。基质金属蛋白酶的主要生理性抑制剂基质金属蛋白酶组织抑制剂(tissue inhibitor of matrix metalloproteinase，TIMPs)，是一个低分子量分型蛋白质家族，目前已确定了4种TIMPs(TIMP-1、TIMP-2、TIMP-3 和 TIMP-4)，每一种都可与MMPs以共价键形式生成1∶1复合物，对活化MMPs具有专一的抑制作用。TIMPs对MMPs活性的抑制作用是MMPs活性的重要调节机制。

有研究表明，牙周组织细胞以及炎症细胞均可表达分泌MMPs，MMPs在牙周组织的降解破坏过程中起着重要的作用。MMP-8属于胶原酶，是与慢性牙周病有密切关系的基质金属蛋白酶［1］。本研究旨在探讨慢性牙周炎患者和健康人群龈沟液中MMP-8和其抑制剂TIMP-1水平，了解慢性牙周炎患者龈沟液MMP-8以及TIMP-1水平与健康人群的差异和变化。

1 资料与方法

1.1 研究对象

30例临床慢性中、重度牙周炎患者作为病例组。选择标准:无系统性疾病，近3个月未使用抗生素及免疫制剂，近3个月未进行牙周药物及手术治疗。每例患者选取1颗牙周袋探诊深度≥4 mm，且颈部无龋损和充填体的第1或第2磨牙作为观察对象。

30例牙周健康者作为对照组。选择标准:无系统性疾病，近3个月未使用抗生素及免疫制剂，近3个月未进行牙周药物及手术治疗。龈沟深度≤2 mm，龈沟探诊不出血，无明显牙龈退缩，牙颈部无龋坏和充填体。每例选取1颗第1或第2磨牙作为观察对象。

1.2 材料与仪器

Whatman 3号滤纸购自英国 Whatman公司，Sorvall LengendRT型低温离心机购自美国Thermo Fisher Scientific公司，酶标仪购自美国Bio-Rad公司，人 MMP-8、TIMP-1 ELISA试剂盒购自美国Biosource公司。

1.3 实验方法

GCF采集及定量:将Whatman 3MM滤纸裁成10 mm×2 mm的纸条，随机取3条放入有标记Ep管中，编号、电子天平称重，吹干患牙，隔湿;将预先称重的滤纸条放入待检牙的取液区(近中、颊面、远中，3位点/牙)，放置30 s，称重，两次称重结果之差即为该牙GCF的重量。样本置于-70°低温冰箱中保存。2周内在室温下解冻样本，每管加入200 μl Tris-HCl液(pH 7.5)，振荡 1 h，低温离心 10 min(4℃，离心半径10 cm，10 000 r/min)，取上清液。样品采用双抗体夹心ABC-Elisa法进行检测，依照试剂盒说明进行样品检测。最后通过绘制标准曲线求出标本中MMP-8以及TIMP-1的浓度。

1.4 统计学处理

数据采用SPSS 19.0统计软件统计完成。采用两样本独立t检验进行检验。P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果

数据显示病例组GCF中MMP-8含量高于正常对照组，两组差异有统计学意义(P＜0.01)。TIMP-1两组间差异无统计学意义。MMP-8/TIMP-1比值差异无统计学意义。病例组龈沟液重量高于对照组，两组差异有统计学意义(P＜0.01)，见表1。

表1 病例组与对照组龈沟液MMP-8、TIMP-1浓度以及MMP-8/TIMP-1比值Tab.1 The expression of MMP-8，TIMP-1 and MMP-8/TIMP-1 ratio in GCF of 2 groups

3 讨 论

牙周病是细菌感染性疾病，致病微生物在牙周病的发生和发展过程中发挥了重要作用。牙周炎所致的组织破坏主要由宿主的炎症介质介导，这种反应包括介导细胞活性和导致组织破坏的细胞因子显著增多［2］。MMPs是降解细胞外基质的重要酶类，对牙周组织的破坏起关键作用。MMPs通过降解破坏牙周支持组织参与牙周组织附着丧失以及牙槽骨的吸收，在牙周病变过程中发挥重要作用。研究表明，多种 MMPs在牙周炎症过程中发挥作用。Rathnayake等［3］研究发现，重症牙周炎患者唾液中MMP-8的浓度显著高于正常人群。Marcaccini等［4］也认为，慢性牙周炎患者龈沟液MMP-8水平显著高于正常组。本实验也发现慢性牙周炎患者龈沟液MMP-8水平明显高于正常对照组。说明牙周炎症可调高MMP-8的分泌水平，参与牙周炎症的发生发展。

近年来的研究发现MMP-8在牙周病的作用尤为重要，研究表明，临床牙周治疗可显著降低MMP-8的水平，提示MMP-8可作为疾病现状的判断指标之一，并且可能用于疾病预后的评估。MMP-8可能作为一项临床指标，用于牙周病诊断以及监测。Mäntylä等［5］由此提出椅旁 MMP-8 检测方法。由于这种检测方法可由牙医独立操作完成，而不需借助专门的仪器，颇具有实用性，故GCF中MMP-8的检测可能成为诊断和监测牙周病发展的实用工具。

本研究发现病例组TIMP-1水平高于正常对照组，但二组间差异无统计学意义。作为MMP-8的抑制剂，TIMP-1广泛存在于体液和组织液中，其对MMP-8的抑制作用也是近年来牙周研究的一个热点。一般认为，MMPs和TIMPs间的平衡调节着细胞外基质的重塑。MMPS/TIMPS的失衡造成组织的吸收。有文献［6］表明，TIMP-1在健康组织中保持较高水平，在早期炎症TIMP-1水平较低。而另有文献则有相反结论，炎症过程中，宿主通过产生TIMP-1作为抗水解蛋白酶来对抗和调节MMPs对组织造成的破坏。所以在炎症组织中，TIMP-1维持较高 水 平，以 对 抗 MMPs 对 组 织 的 破 坏［7-9］。Marcaccini等［10］则认为慢性牙周炎患者与正常人群龈沟液中TIMP-1水平无差异，但两组间MMP-8/TIMP-1比值有显著差异，由此推论MMP-8的升高是导致MMP-8/TIMP-1失衡的原因。体外研究发现，牙龈卟啉单胞菌可以降解TIMP-1，使TIMP-1失去活性。牙龈卟啉单胞菌可能通过失活TIMP-1，使得炎症位点MMPS水平增高，造成牙周组织的损伤［11］。由此可见，MMPs、TIMP-1 与牙周病发展有着更加复杂的关系。MMPs/TIMPs二者的平衡，对维持牙周健康具有重要作用。

［1］ Hannas AR，Pereira JC，Granjeiro JM，et al.The role of matrix metalloproteinases in the oral environment［J］.Acta Odontologica Scandinavica，2007，65(1):1-13.

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［10］ Marcaccini AM，Meschiari CA，Zuardi LR，et al.Gingival crevicular fluid levels of MMP-8，MMP-9，TIMP-2，and MPO decrease after periodontal therapy［J］.J Clin Periodontol，2010，37(2):180-190.

［11］ Grenier D，Mayrand D.Inactivation of tissue inhibitor of metalloproteinases-1(TIMP-1)by Porphyromonas gingivalis［J］.FEMS Microbiol Lett，2001，203(2):161-164.