牯岭勾儿茶多糖对老龄小鼠免疫功能及抗氧化能力的影响

俞浩，张孝林，毛斌斌，路方方

（安徽科技学院 食品药品学院，安徽 蚌埠233100）

牯岭勾儿茶（Berchemia kulingensis Schneid）为鼠李科勾儿茶属植物，分布于安徽、江苏、浙江等省，生于山谷灌丛、林缘或林中。自古以来，安徽滁州一带百姓采其叶芽炒制加工为茶，习称“藤茶”，长期饮用具有保肝养颜、降压降脂等功效。我国勾儿茶属植物有18种，6变种，主要集中于西南、华南、中南及华东地区，本属大部分植物的根、茎或叶均可药用，具有祛风利湿、活血止痛、止咳祛痰功效，主要用于治疗风湿性关节炎、气管炎、肺结核、黄疸、痈肿疮毒、跌打损伤等症。化学成分及药理作用研究表明，勾儿茶属植物中含有黄酮类、木脂素类、苷类、黄酮和多糖等成分，从该属植物中分离得到二聚体化合物具有保肝、抑菌、止咳平喘、抗组胺、抑酶等多种生物活性[1]。植物多糖具有抗肿瘤、增强机体免疫功能、抗氧化、调节血糖血脂、抗病毒等多种药理活性，且毒副作用低，因此，有关植物多糖的研究和开发应用较为广泛[2]。但当前有关牯岭勾儿茶及其成分生物活性的研究尚未见文献报道。本研究以自然衰老小鼠为研究对象，观察牯岭勾儿茶多糖对其免疫功能及抗氧化能力的影响，以期为牯岭勾儿茶资源的开发利用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

昆明种小鼠（体质量 42±2g） 雌雄各半，由安徽医科大学实验动物中心提供，合格证号为：SCXK(皖)2007-001，实验室饲养至19月龄供试验用；牯岭勾儿茶多糖 安徽科技学院中药及药物制剂实验室制备（水提醇沉法制备，sevage法脱蛋白，硫酸-苯酚显色法测定多糖质量分数为 78.32%），将多糖水解、乙酰化后，气质联用分析结果显示，牯岭勾儿茶多糖主要含D-半乳糖、D-葡萄糖、D-阿拉伯糖、D-甘露糖组成，质量分数分别为36.4%、16.3%、25.6%、14.7%；玉屏风颗粒 广东环球制药有限公司，批号130316；中华墨水 上海精细文化用品有限公司，批号：120301，临用时用生理盐水稀释 5倍；IgG、IgM、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽还原酶（GSH-Px）、丙二醛（MDA）试剂盒 均购自南京建成生物工程研究所。

FA2104B电子分析天平 上海越平科学仪器有限公司；TU-1810紫外可见分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司；TG16-WS台式高速离心机 长沙湘仪离心机仪器有限公司；数显恒温水浴锅 常州国华电器有限公司；Multiskan FC型酶标仪 赛默飞世尔（上海）仪器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 牯岭勾儿茶多糖对老龄小鼠炭粒廓清功能及免疫器官指数的影响 取小鼠50 只，雌雄各半，随机分为牯岭勾儿茶多糖高、中、低剂量组（剂量分别为 40、20、10mg/kg，给药时用生理盐水配制至所需浓度），玉屏风颗粒组（剂量为5.0g/kg）和正常对照组。灌胃给药，给药容积为0.2mL/10g体重，每日1次，连续7d，正常对照组给等容积的生理盐水。末次给药后30min，小鼠称重，然后经尾静脉注射中华墨水0.1mL/10g体重，分别于注射后2、10min小鼠眼眶后静脉丛采血20µL，立即加入2mL 0.1% Na2CO3溶液中，采用分光光度计在680nm 处测定OD值。另取未注射墨汁正常小鼠血20µL加入2mL 0.1% Na2CO3溶液作空白对照。处死动物，摘取肝脏、脾脏和胸腺，称重。计算廓清指数K 值和吞噬指数α，K=(logA1-logA2)/(t2-t1)，其中A1、A2分别代表采血样测得的吸光度，t2、t1分别代表两次采血的时间间隔；α= K1/3×体重/(肝重+脾重)。计算脾脏指数和胸腺指数。胸腺指数（mg/g）=胸腺重量/小鼠体重，脾脏指数（mg/g）=脾脏重量/小鼠体重[3-4]。

1.2.2 牯岭勾儿茶多糖对老龄小鼠血清免疫球蛋白水平的影响 分组及给药同“1.2.1”。末次给药后 30min，小鼠称重，摘眼球取血，离心分离血清，备用[5]。取血清，按试剂盒说明书操作方法，ELISA法测定血清中IgG、IgM含量。

1.2.3 牯岭勾儿茶多糖对老龄小鼠血清及肝脏SOD、GSH-Px活性及MDA含量的影响

分组及给药同“1.2.1”。末次给药后30min，摘眼球取血，3600r/min离心分离血清，冰箱保存备用。颈椎脱臼处死小鼠，取肝脏，生理盐水洗净，滤纸吸尽水分，剪取部分肝脏，电子天平称重后置玻璃匀浆器中，按质量体积比 1:9 加生理盐水匀浆，匀浆液 3600r/min 离心 15min，取上清，待测[6-8]。按试剂盒说明书操作方法测定小鼠血清和肝脏中SOD、GSH-Px活性及MDA含量。

1.3 数据处理与统计方法

2 结果与分析

2.1 牯岭勾儿茶多糖对老龄小鼠炭粒廓清功能的影响

碳粒廓清指数是反映机体非特异性免疫功能的重要指标，随着年龄的增加，巨噬细胞的吞噬功能降低，碳粒廓清功能下降。本实验结果表明，牯岭勾儿茶多糖高剂量组小鼠碳粒廓清指数和吞噬指数显著提高，与正常对照组比较具有极显著差异（p＜0.01），说明牯岭勾儿茶多糖能够提高老龄小鼠的非特异性免疫功能。结果见表1。

表1 牯岭勾儿茶多糖对老龄小鼠炭粒廓清功能的影响(±s，n=10)Table 1 Effect of Berchemia kulingensis polysaccharide on carbon clearance function in aged mice(±s，n=10)

表1 牯岭勾儿茶多糖对老龄小鼠炭粒廓清功能的影响(±s，n=10)Table 1 Effect of Berchemia kulingensis polysaccharide on carbon clearance function in aged mice(±s，n=10)

注：与正常对照组比较*p＜0.05，**p＜0.01。表2-表5同。

组别 剂量（g/kg） 廓清指数（K）×102 吞噬指数（α）正常对照组 — 2.97±0.52 6.17±0.37玉屏风颗粒组 5.0 3.77±0.63** 6.69±0.36**牯岭勾儿茶多糖高剂量组 0.04 3.85±0.58** 6.74±0.34**牯岭勾儿茶多糖中剂量组 0.02 3.50±0.82 6.51±0.49牯岭勾儿茶多糖低剂量组 0.01 3.34±0.71 6.41±0.47

2.2 牯岭勾儿茶多糖对老龄小鼠免疫器官指数的影响

随着年龄的增长，免疫器官老化、萎缩，机体的免疫功能逐渐减弱。与正常对照组比较，牯岭勾儿茶多糖高、中剂量组小鼠脾脏指数显著增加，差异具有显著性意义（p＜0.05或p＜0.01）；与正常对照组比较，牯岭勾儿茶多糖高、中、低剂量组小鼠胸腺指数亦显著增加，差异具有显著性意义（p＜0.05或p＜0.01）。结果表明牯岭勾儿茶多糖能抑制衰老引起的脾脏和胸腺的萎缩，且其作用呈剂量依赖关系。结果见表2。

表2 牯岭勾儿茶多糖对老龄小鼠免疫器官指数的影响(±s，n=10)Table 2 Effect of Berchemia kulingensis polysaccharide on immune organ index in aged mice(±s，n=10)

表2 牯岭勾儿茶多糖对老龄小鼠免疫器官指数的影响(±s，n=10)Table 2 Effect of Berchemia kulingensis polysaccharide on immune organ index in aged mice(±s，n=10)

组别 剂量/（g/kg） 脾脏指数（mg/g体重） 胸腺指数（mg/g体重）正常对照组 — 5.09±0.84 3.26±0.70玉屏风颗粒组 5.0 6.53±0.98** 4.67±1.26**牯岭勾儿茶多糖高剂量组 0.04 6.34±0.94** 4.52±1.10**牯岭勾儿茶多糖中剂量组 0.02 6.19±1.14* 4.70±0.88**牯岭勾儿茶多糖低剂量组 0.01 5.13±1.09 4.19±0.93*

2.3 牯岭勾儿茶多糖对老龄小鼠血清免疫球蛋白水平的影响

衰老小鼠血清中免疫球蛋白水平下降。与正常对照组比较，牯岭勾儿茶多糖高剂量组小鼠血清 IgG、IgM水平显著升高，差异具有显著性意义（p＜0.01），说明牯岭勾儿茶多糖能提高老龄小鼠血清免疫球蛋白水平。牯岭勾儿茶多糖中、低剂量组小鼠血清 IgG、IgM 水平有升高趋势，但与正常对照组比较无显著性差异（p＞0.05）。结果见表3。

表3 牯岭勾儿茶多糖对老龄小鼠血清免疫球蛋白水平的影响(±s，n=10)Table 3 Effect of Berchemia kulingensis polysaccharide on serum immune globulin in aged mice(±s，n=10)

表3 牯岭勾儿茶多糖对老龄小鼠血清免疫球蛋白水平的影响(±s，n=10)Table 3 Effect of Berchemia kulingensis polysaccharide on serum immune globulin in aged mice(±s，n=10)

组别 剂量（g/kg） IgG（mg/L） IgM（mg/L）正常对照组 — 249.61±22.16 78.6±24.83

玉屏风颗粒组 5.0 298.31±32.24** 121.11±38.61牯岭勾儿茶多糖高剂量组 0.04 286.46±29.74** 113.27±21.69**牯岭勾儿茶多糖中剂量组 0.02 270.26±42.59 94.27±33.48牯岭勾儿茶多糖低剂量组 0.01 266.37±23.34 89.63±31.27

2.4 牯岭勾儿茶多糖对老龄小鼠血清SOD、GSH-Px活性及MDA含量的影响

随着机体的衰老，体内抗氧化酶活性下降，过氧化产物生成增多，自由基生成和消除失衡，氧自由基的大量积聚，造成组织细胞的过氧化损伤。牯岭勾儿茶多糖高剂量组小鼠血清SOD活性显著升高，与正常对照组比较具有显著性差异（p＜0.05）；牯岭勾儿茶多糖高、中剂量组小鼠血清GSH-Px活性显著升高，与正常对照组比较具有显著性差异（p＜0.05 或p＜0.01）；牯岭勾儿茶多糖高、中剂量组小鼠血清MDA含量显著下降，与正常对照组比较具有极显著性差异（p＜0.01）。说明牯岭勾儿茶多糖具有抗过氧化损伤作用。结果见表4。

表4 牯岭勾儿茶多糖对老龄小鼠血清SOD、GSH-Px活性及MDA含量的影响(±s，n=10)Table 4 Effect of Berchemia kulingensis polysaccharide on activities of SOD,GSH-Px and content of MDA in serum in aged mice(±s，n=10)

表4 牯岭勾儿茶多糖对老龄小鼠血清SOD、GSH-Px活性及MDA含量的影响(±s，n=10)Table 4 Effect of Berchemia kulingensis polysaccharide on activities of SOD,GSH-Px and content of MDA in serum in aged mice(±s，n=10)

组别 剂量/（g/kg） SOD/（nU/mL） GSH-Px/（nU/mL） MDA/（nmol/mL）正常对照组 — 194.71±27.82 26.09±5.07 10.17±2.11玉屏风颗粒组 5.0 247.50±35.77** 36.00±5.42** 7.26±2.99**牯岭勾儿茶多糖高剂量组 0.04 239.65±41.90* 35.38±5.31** 6.34±1.73**牯岭勾儿茶多糖中剂量组 0.02 227.60±42.98 31.43±4.06* 7.26±1.44**牯岭勾儿茶多糖低剂量组 0.01 207.15±46.85 29.68±6.92 8.33±2.30

2.5 牯岭勾儿茶多糖对老龄小鼠肝脏SOD、GSH-Px活性及MDA含量的影响

与正常对照组比较，牯岭勾儿茶多糖高、中剂量组小鼠肝脏SOD活性显著升高，差异具有显著性意义（p＜0.01或p＜0.05）；牯岭勾儿茶多糖高剂量组小鼠肝脏GSH-Px活性显著升高，与正常对照组比较具有显著性差异（p＜0.05）；牯岭勾儿茶多糖高剂量组小鼠血清MDA含量显著下降，与正常对照组比较具有显著性差异（p＜0.05）。说明牯岭勾儿茶多糖具有抗肝脏脂质过氧化损伤作用。结果见表5。

表5 牯岭勾儿茶多糖对老龄小鼠肝脏SOD、GSH-Px活性及MDA含量的影响( ±s，n=10)Table 5 Effect of Berchemia kulingensis polysaccharide on activities of SOD,GSH-Px and content of MDA in liver in aged mice(±s，n=10)

表5 牯岭勾儿茶多糖对老龄小鼠肝脏SOD、GSH-Px活性及MDA含量的影响( ±s，n=10)Table 5 Effect of Berchemia kulingensis polysaccharide on activities of SOD,GSH-Px and content of MDA in liver in aged mice(±s，n=10)

组别 剂量/（g/kg） SOD（nu /mg pro） GSH-Px（U /mg pro） MDA（nmol /mg pro）正常对照组 — 108.91±26.03 31.20±8.67 21.82±4.68玉屏风颗粒组 5.0 141.81±20.97** 39.75±6.30** 17.27±2.61*牯岭勾儿茶多糖高剂量组 0.04 138.82±16.84** 38.58±4.69* 17.36±2.88*牯岭勾儿茶多糖中剂量组 0.02 131.89±14.78* 34.86±5.58 18.85±3.78

牯岭勾儿茶多糖低剂量组 0.01 118.41±31.07 33.13±4.50 19.89±5.53

3 结论

衰老机制复杂，其中免疫学理论和自由基理论在众多理论中占有重要地位[9-10]。本研究从免疫学和自由基的角度探讨牯岭勾儿茶多糖对老龄小鼠的免疫功能和抗氧化作用的影响。

玉屏风散为中医临床常用方剂，可敛汗固表，被称为中药免疫调节剂。研究表明，玉屏风散能显著提高正常小鼠的胸腺和脾脏指数, 促进溶血素生成和溶血空斑的形成, 促进淋巴细胞转化，升高小鼠血清和肝组织中SOD、GSH-Px活性，降低MDA含量，具有显著免疫促进和抗氧化作用[11-12]。本实验结果亦证实，玉屏风散具有显著的提高免疫功能和抗氧化作用。因此，本研究选用玉屏风散作为阳性对照药物。

衰老的免疫学理论认为，免疫系统参与衰老过程，随着年龄的增长，免疫器官老化、萎缩，免疫细胞和细胞因子发生变化，机体的免疫功能逐渐减弱。胸腺和脾脏是机体重要的免疫器官，胸腺指数和脾脏指数是衡量机体非特异性功能的重要指标。胸腺为中枢免疫器官，其能诱导胸腺细胞分化成熟为功能不同的T细胞亚群，是T细胞发育、分化和成熟的场所，成熟的T细胞经血液或淋巴液转移至外周免疫器官，接受抗原刺激，产生免疫应答，发挥免疫效应；同时胸腺还能诱导胸腺细胞对自身抗原形成免疫耐受[13]。脾脏为外周免疫器官，是人体最大的免疫器官，是具有免疫活性的T、B 细胞移居和接受抗原刺激后产生免疫应答的重要场所[14]。IgG主要由脾脏、淋巴结和骨髓中的浆细胞合成，是再次体液免疫应答产生的全身性体液免疫反应的效应因子，在血液中含量最高，在机体防御中主要发挥发挥抗菌、抗病毒和中和毒素等作用，其含量在一定程度上反映了对机体体液免疫的调节功能。IgM是最早出现的免疫球蛋白，也是一级免疫应答中所产生的主要免疫球蛋白，也产生于二级免疫应答，其生成数量较少，但在激活补体、调理作用、中和病毒和凝集作用等方面比IgG更有效[15]。本实验研究结果表明，牯岭勾儿茶多糖能明显提高老龄小鼠碳粒廓清指数和吞噬指数，增加胸腺指数和脾脏指数，提高血清中IgG和IgM水平，说明牯岭勾儿茶多糖能够增强老龄小鼠的免疫功能。

衰老的自由基理论认为，随着年龄的增加，机体的抗氧化酶活性下降，过氧化产物增多，自由基生成和消除失衡，氧自由基的大量积聚使细胞膜上的脂肪酸生成过氧化物，进一步生成脂褐素，造成核酸、蛋白质损伤，产生过氧化损伤。SOD和GSH-Px是机体的主要抗氧化酶，其中SOD能催化氧自由基发生歧化反应，生成H2O2，GSH-Px能迅速清除H2O2，两者共同发挥作用使组织细胞免受过氧化损伤。MDA为生物膜不饱和脂肪酸-花生四烯酸的过氧化产物，是衡量体内自由基代谢情况的重要指标，能够客观反映体内的自由基的水平[16]。本实验研究结果显示，牯岭勾儿茶多糖能升高血清和肝脏中SOD、GSH-Px活性，降低血清和肝脏中MDA含量，说明牯岭勾儿茶多糖能提高机体抗氧化能力和清除自由基能力，抑制脂质过氧化反应，进而延缓衰老的进程。

[1]陈立,董俊兴.勾儿茶属植物化学成分及其生物活性研究进展[J].中草药, 2006,37(4):627-630.

[2]安晓娟,冯琳,宋红平,等.植物多糖的结构分析及药理活性研究进展[J].中国药学杂志,2012,47(6):1271-1275.

[3]俞浩,周金星,马世堂,等.滁菊总黄酮对糖尿病大鼠血液流变学的影响[J].食品工业科技,2013,34(15):351-354.

[4]王思芦,汪开毓,赵玲,等.鸡枞菌多糖对免疫抑制小鼠免疫功能的影响[J].中国药理学通报.2013,29(1):59-63.

[5]熊奇凌,何胜旭,林军,等.抗痨胶囊对免疫功能低下小鼠影响的实验研究[J].中国中药杂志,2013,38(5):740-742.

[6]孙伟,苗珍花,王亚玲,等.宁夏枸杞叶对自然衰老小鼠的抗疲劳作用[J].宁夏医科大学学报,2011,33(3):204-205.

[7]申佳佳,苑隆国,李电东,等.红景天苷对自然衰老小鼠模型的抗衰老作用研究[J].中国医药生物技术,2012,7.(6):412-417.

[8]吴聪, 施用晖, 乐国伟.奥曲肽对高脂饲养小鼠血糖、血脂及抗氧化能力的影响[J].食品与生物技术学报，2012,37(7):745-751.

[9]Tomoko Kaburagi,Toshihiko Yamano,Yoichi Fukushima,et al.Effect of Lactobacillus johnsonii La1 on immune function and serum albumin in aged and malnourished aged mice[J]. Nutrition, 2007,23(4): 342-350.

[10]Brink TC,Regenbrecht C,Demetrius L,et al. Activation of the immune response is a key feature of aging in mice[J].Biogerontology,2009,10(6):721-34.

[11]王妍，石学魁.玉屏风散增强小鼠免疫功能的研究[J].牡丹江医学院学报,2010,31(3):46-47.

[12]王玉阁,周丽,王丽萍,等.玉屏风散生物转化液对正常小鼠抗氧化功能及免疫抑制小鼠T细胞亚群、IL-4 和IFN-γ的影响[J]. 齐齐哈尔医学院学报,2009,30(5):513-515.

[13]Yan-Mei Tian,Gui-You Zhang,Yao-Ren Dai.Melatonin rejuvenates degenerated thymus and redresses peripheral immune functions in aged mice[J].Immunology Letters, 2003,88 (2 ):101-104.

[14]钟振国,罗雪菲,黄金兰,等.余甘子叶提取物对小鼠免疫功能的影响研究[J].中药材,2013,36(3):441-444.

[15]胡锡琴,李娅琳,林飞,等.何首乌、制何首乌对大鼠免疫球蛋白影响的实验研究[J].天津中医药,2009,26(2):139-141

[16]Bokov A,Chaudhuri A,Richardson A.The role of oxidative damage and stress in aging[J].Mech Aging Dev，2004,125( 10-11): 811-26.