霸王花提取物抗氧化和抗菌活性研究

李本杰，黄茂春，廖艳芳，陈 睿，* ，吕金燕

(1.广西中医药大学赛恩斯新医药学院，广西南宁530222;2.广西化工研究院，广西南宁530001)

霸王花为仙人掌科量天尺属植物量天尺(Hylocereus undatus(Haw.)Britt.et Rose)的花，别名剑花、量天尺，原产墨西哥、广西一带，我国主要分布于广东、广西、海南等地［1］。霸王花性味甘微寒，具有丰富的营养价值和药用价值，对治疗肺结核、支气管炎、颈淋巴结核、腮腺炎、脑动脉硬化、心血管疾病有明显疗效［1－2］。王宏磊等［3］研究了霸王花水提物及其皂苷成分对DPPH自由基清除能力，结果表明霸王花具有一定的抗氧化能力。易衍等［4］从霸王花中分离并鉴定了13种黄酮醇及其苷类化合物，这些化合物被证明具有很好的抗氧化活性［5］。虽然研究中已对霸王花的水提物及其皂苷成分的DPPH抗氧化能力进行初步的评价，但对霸王花不同溶剂提取物的其它抗氧化体系以及抗菌能力的筛选未进行过报道。

本实验采用当前较为普遍的清除DPPH自由基、清除ABTS自由基和铁离子还原能力检测3种体外抗氧化活性分析方法，对霸王花不同溶剂提取物抗氧化活性进行了考察;并测定其对金黄色葡萄球菌、枯草芽胞杆菌、大肠埃希菌、绿脓杆菌、伤寒杆菌五种菌的抑菌圈大小和最小抑菌浓度，考察霸王花各提取物的抗菌能力。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

霸王花 采于广西德保县，经广西中医学院壮医药学院韦松基教授鉴定为Hylocereus undatus(Haw.)Britt.et Rose;DPPH(二苯代苦味酰自由基)，ABTS(2，2'－联氨－双(3－乙基苯并噻唑啉－6－磺酸)二铵盐)购于美国Sigma Aldrich公司;BHT(2，6－二叔丁基－4－甲基苯酚)购于美国Sigma Aldrich公司;标准菌种(金黄色葡萄球菌ATCC25923;枯草芽胞杆菌ATCC6633;大肠埃希菌 ATCC35218;绿脓菌ATCC27853;伤寒杆菌ATCC10231)购于广西医科大学实验中心;其他试剂均为分析纯。

Tu－1800 SPC紫外可见分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司;SHB－Ⅲ循环水式多用真空泵 郑州长城科工贸有限责任公司;RE－52AA旋转蒸发器 上海亚荣生化仪器厂;LDZM－40KCS立式压力蒸汽灭菌器 上海茸研仪器有限公司;CRY－211卧式恒温摇床 上海茸研仪器有限公司。

表1 最小抑菌浓度测定实验Table 1 The determination test of minimum inhibitory concentration

1.2 实验方法

1.2.1 部位提取 霸王花干燥花朵，粉碎后各称取50g，用250mL 95%乙醇冷浸2d，过滤。滤渣加等量溶剂同法再提取一次，过滤，合并两次滤液。滤液置旋转蒸发仪中减压蒸馏，回收溶剂，残留物低温真空干燥至干，得霸王花乙醇提取物(EE)，得率为11.2%。同法制备丙酮提取物(AE)和乙酸乙酯提取物(EAE)，得率分别为4.23%和3.25%。

1.2.2 抗氧化能力测定

1.2.2.1 清除ABTS自由基的能力测定 参照文献［6］，用去离子水将ABTS配制成7mmol/L储备液，加入 K2S2O8固体，使储备液中 K2S2O8浓度达到2.45mmol/L，于室温避光放置2d备用;用0.01mol/L的PBS(pH7.4)稀释，使其在732nm下测得吸光度在0.700±0.050范围内;将50μL不同浓度的霸王花药液，混合1.9mL ABTS溶液，在室温下放置3min后测其吸光度，BHT做阳性对照。

式中，Acontrol为不加药液的ABTS溶液的吸光度，Atest为加入药液的ABTS溶液的吸光度。

1.2.2.2 清除DPPH自由基的能力测定 参照文献［6］，取0.2mL不同浓度的霸王花提取物溶液加入8mL DPPH(0.004%)溶液中，在最大波长处(517nm)测吸光度，BHT做阳性对照。

其中，A空白为未加药液的DPPH溶液的吸光度，A样品为加入药液的DPPH溶液的吸光度。

1.2.2.3 还原能力测定 参照文献［7］，取0.8mL霸王花不同浓度的提取物溶液，加入2.5mL 0.01mol/L的PBS(pH7.4)溶液，2.5mL KFe(CN)4(1%);上述混合物于50℃恒温20min后，加入2.5mL三氯乙酸溶液(10%)，离心10min;取上清液2.5mL，加入2.5mL蒸馏水，0.5mL FeCl3(1%)，混匀。在700nm处测定吸光度，以蒸馏水为参比，BHT做阳性对照。

1.2.3 提取物抗菌能力测定

1.2.3.1 培养基制备 MH琼脂:MH琼脂粉42g，溶解于1000mL蒸馏水中，121℃高压灭菌15min;MH肉汤:MH肉汤粉21g，溶解于1000mL蒸馏水中，121℃高压灭菌15min。

1.2.3.2 菌液制备 参照文献［8］，将菌种分别于MH琼脂平板上分区划线，37℃培养24h;接种环分别挑取各菌单个菌落接种于MH肉汤中，于37℃培养24h;用麦氏比浊法调整每种菌的浓度，最终浓度为1.5 ×106CFU/mol。

1.2.3.3 滤纸片扩散法 参照文献［8］，取0.1mL的菌悬液用无菌涂布棒均匀涂布于平板培养基(约15mL)，将灭菌后直径9mm的滤纸圆片在药液(浓度250μg/mL)中浸泡20min后取出，等距离贴于平板上，每皿放4片，每菌种做3个平皿。以无菌水为空白对照，青霉素为革兰氏阳性细菌的阳性对照，黄连素作为革兰氏阴性菌的阳性对照。

1.2.3.4 试管法(MIC)参照文献［9］，如表1，测定采用试管二倍稀释法，取无菌试管9支，第1管加入无菌肉汤1mL作为阴性对照，第2～8管将各供试中药液依次作二倍梯度稀释，第9管不加药液作为阳性对照;然后在第2～9管各加入50μL培养8h的供试菌液，充分摇匀后，于37℃培养24h，观察结果。

2 结果与分析

2.1 霸王花抗氧化能力

2.1.1 ABTS自由基清除能力 由图1可以看出，三种提取物中，EAE表现出最强的ABTS自由基清除能力，在浓度为2mg/mL时，清除率可达80%，但仍弱于阳性对照BHT。

EE、AE、EAE、BHT 的 IC50分别为:1.82、1.89、0.79和0.62mg/mL，因此，这三种溶剂提取物和阳性对照清除ABTS自由基的能力强弱顺序为:BHT＞EAE＞EE＞AE。

2.1.2 DPPH自由基清除能力 从图2可看出，EAE、AE和EE对DPPH自由基均有清除作用，并且在一定剂量内呈正量效关系，即三种提取物自由基清除能力与其浓度成正比。EAE表现最强清除能力，当浓度为2mg/mL时，清除率可达到78.2%，但仍弱于阳性对照BHT。

EE、AE、EAE、BHT 的 IC50分别为:1.32、2.30、0.73和0.62mg/mL，因此，这三种溶剂提取物和阳性对照清除DPPH自由基的能力强弱顺序为::BHT＞EAE＞EE＞AE。

表2 霸王花对五种菌的抑菌效果Table 2 Five kinds of bacteria antibacterial effect of different extracts from the flowers of Hylocereus undatus

图1 霸王花不同极性溶剂提取部位清除ABTS自由基能力Fig.1 ABTS radical scavenging activity of different extracts from the flowers of Hylocereus undatus

2.1.3 还原能力 在波长700nm条件下测定吸光度A，A越大，则样品的还原力越大。从图3中可以看出，随着浓度增大，霸王花提取物的吸光度逐渐增大，这三种提取物中在浓度小于1.2mg/mL时，还原能力相差不大，EAE在浓度大于1.2mg/mL时，还原能力大于其它两种提取物，但弱于阳性对照BHT。

以上实验结果表明:不同溶剂提取物中提取成分的不同，导致了抗氧化能力有所差异，其中EAE表现出最强的抗氧化能力，但弱于阳性对照BHT。

2.2 霸王花的不同极性提取物的体外抗菌活性

2.2.1 霸王花的不同极性提取物的体外抗菌活性 由表2可知，霸王花的EE对枯草芽孢杆菌有较小的抑制效果，抑菌圈大小为10mm，霸王花的AE对金黄葡萄球菌有较小的抑制效果;但是可以看到，EAE对于金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、绿脓杆菌和伤寒杆菌有一定的抑制效果，特别是其伤寒杆菌的抑菌圈大小为19mm，与作为革兰氏阳性菌的对照品黄连素抑菌圈大小25mm非常接近。

2.2.2 霸王花的不同极性提取物最小抑菌浓度 由2.2.1的抑菌实验结果，本实验选取霸王花的EAE对于大肠杆菌、伤寒杆菌和绿脓杆菌的最小抑菌浓度进行测定。

由表3可知，霸王花的EAE对大肠杆菌、伤寒杆菌和绿脓杆菌的最小抑菌浓度分别为100、12.5、200mg/mL;乙酸乙酯提取物(EAE)对伤寒杆菌有明显抑菌效果，最小抑菌浓度为12.5mg/mL。

表3 霸王花的EAE最小抑菌浓度Table 3 The minimum inhibitory concentration of the EAE from the flowers of Hylocereus undatus

3 结论

本文采用DPPH自由基、ABTS自由基和铁离子还原能力三种方法对霸王花提取物的体外抗氧化活性进行研究，各提取物均表现出一定的抗氧化能力，其抗氧化能力的顺序均为:EAE＞EE＞AE。通过与阳性对照BHT比较，结果表明，各提取物的抗氧化性均弱于BHT。此外，除枯草芽孢杆菌外，霸王花EAE对其余四种细菌具有一定的抑制作用，尤其对伤寒杆菌作用效果明显，其最小抑菌浓度为12.5mg/mL。综合上述结果可得出霸王花乙酸乙酯提取部分的抗氧化及抑菌活性最好，具有作为天然抗氧化剂和天然抗菌素研究和开发的潜力。

［1］国家中医药管理局中华本草编委会.中华本草［M］.第六卷.上海:上海科学技术出版社，2004:865.

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