镍钛合金裸支架对内皮细胞低密度脂蛋白穿胞影响的初步研究

陶然 熊斌 郑传胜 梁明 王奇 曾军

•基础研究•

镍钛合金裸支架对内皮细胞低密度脂蛋白穿胞影响的初步研究

陶然 熊斌 郑传胜 梁明 王奇 曾军

目的 探讨镍钛合金裸支架是否影响低密度脂蛋白（LDL）在人脐静脉内皮细胞（HUVEC）中的穿胞并初步探讨可能的机制。方法 ①培养HUVEC，利用细胞培养小池模拟血管内皮单层细胞，建立穿胞模型；②将镍钛合金裸支架作用于HUVEC上，加入异硫氰酸荧光素（FITC）标记的LDL，分别培养3 h及24 h；③通过测定培养小池内外FITC-LDL的量，研究镍钛合金裸支架对LDL在HUVEC中穿胞过程的影响。结果 3 h及24 h时镍钛合金裸支架作用下LDL在HUVEC中的穿胞量均增加。结论 在LDL和HUVEC构建的穿胞模型实验中, 镍钛合金裸支架可以促进LDL的穿胞。

低密度脂蛋白； 支架； 人脐静脉内皮细胞； 穿胞

随着生活水平的不断提高，血管性疾病（包括心血管疾病、脑血管疾病、外周血管疾病等）的发病率不断升高，动脉支架置入术的应用虽减少了心脑血管事件的发生，但有20%～30%的金属裸支架植入患者在6个月内出现了支架内再狭窄（in-stent restenosis，ISR）[1]，使用药物涂层支架可使再狭窄发生率降至7%[2]，但远期再狭窄率与普通金属裸支架并无差别[3]。

动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）是许多心脑血管疾病的病理基础，大量研究表明血管内皮细胞功能障碍是AS的始发事件[4]，当内皮细胞功能受损时，氧化型低密度脂蛋白(oxygenized low density lipoprotein, ox-LDL)的增加，启动了粥样斑块的形成和发展，继而导致了血管的狭窄[5]。内皮细胞的功能障碍作为AS发生的重要原因在支架置入术后并未得到相应改善，相反，支架对血管内皮的作用可能进一步加重了血管内皮细胞的功能障碍，动物实验显示再狭窄的严重程度与内皮细胞功能密切相关，临床的随访中也发现支架置入术后内皮细胞功能障碍较球囊扩张成形术更为严重[6]。我们推测支架可能引起或加重了内皮细胞的功能障碍，导致更多LDL通过内皮细胞并在内膜下氧化，形成更多的ox-LDL，从而引起泡沫细胞形成、炎症反应等一系列改变，最后导致粥样斑块的形成，加重AS进程，并可能诱发新的AS，最终引起或参与血管支架内的再狭窄。

为了证实我们的推测，我们制备了LDL穿过人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVEC）的LDL穿胞模型[7]，观察镍钛合金支架是否影响了低密度脂蛋白（low density lipoprotein, LDL）穿胞作用。实验中，我们采用HUVEC作为研究对象，因其具有血管内皮细胞的各种功能，可以被作为研究血管疾病的工具[8]。

材料与方法

一、支架

Covidien公司生产的ev3镍钛合金记忆支架。

二、主要试剂与仪器

内皮细胞培养基（ECM，ScienCell公司），胎牛血清（FBS HyClone公司），胰酶（Amresco公司），链-青霉素，LDL，异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate，FITC），Transwell，超净工作台，细胞培养箱（37℃，5%CO2），高压锅，离心机，水浴箱，烤箱，光学显微镜，扫描电子显微镜（SEM），全波长荧光酶标仪（USA）。

三、实验方法

1. HUVEC细胞培养：体外培养HUVEC，细胞生长于含l0%胎牛血清及1%的青-链霉素的ECM培养瓶内，在5%CO2、37℃培养箱中孵育，使用含0.25% EDTA的胰酶消化细胞，每1～2天换液一次，3～4天传代一次，光学显微镜下观察细胞生长状态。

2. 支架材料的处理：将支架材料裁剪成直径长约8 mm、宽约5 mm的小方片，每次使用前均需经超声及高压消毒，使用时将其置于Transwell的内室小池中。

3. FITC标记：LDL 实验前使用FITC对LDL进行荧光标记，4℃避光保存。

4. HUVEC与镍钛合金支架材料联合培养（支架对穿胞作用影响）传至第2～3代的HUVEC，使用胰酶将其从细胞培养瓶中消化下来，并均匀种植于直径为24 mm的Transwell的细胞培养小池中，37℃、5%CO2培养箱中孵育，隔天换1次培养液，待1～2天细胞附壁生长并形成致密单层，光镜下观察细胞融合情况，支架处理前需使用无血清ECM对细胞进行培养，待观察到融合率达到90%左右，将镍钛合金支架轻轻平铺于单层HUVEC上，空白对照组不加入支架材料，在每组加入FITC标记的LDL，待培养第3 h及24 h后，取每组孔中液体样本于酶标板，注意尽量避光条件，使用酶标仪测量荧光OD值，计算外室的LDL含量,最终得出LDL的穿胞量。

四、统计学分析

数据分析采用SPSS 19.0统计软件，所有数据均以x±s表示，采用单因素方差分析，P＜0.05表示差异有统计学意义。

结 果

支架作用HUVEC 3 h及24 h，LDL的穿胞量均有所增加。

图1 镍钛合金支架作用3h，LDL穿胞结果

图2 镍钛合金支架作用24h，LDL穿胞结果

讨 论

本实验中，3 h及24 h镍钛合金支架作用组LDL的穿胞量均增加。通常认为，LDL主要是在血管壁的内皮下层被氧化，变成ox-LDL，之后被血管内皮细胞吸收；ox-LDL通过炎症与免疫因素的一系列复杂的相互作用，以细胞死亡的方式导致脂质堆积加速和泡沫细胞形成，最终促进AS的发生和发展。

ox-LDL对内皮细胞有较强的损害作用，机制包括：①通过细胞毒性作用损伤内皮细胞，ox-LDL对血管内皮组织、平滑肌细胞有较强的毒性，引起内皮细胞功能障碍和通透性增高。一方面ox-LDL释放的溶血卵磷脂进入内皮细胞膜，改变血管的生理作用,使血管对一些松弛因子失去反应；另一方面ox-LDL脂质过氧化物能使动脉内皮细胞、平滑肌细胞坏死，并增强脂质蛋白对动脉壁的通透性。②参与氧化应激，ox-LDL通过各种途径导致体内一氧化氮（NO）大量失活,从而减弱NO清除超氧化物的作用，进一步引起LDL的氧化,另外ox-LDL的细胞毒性作用可造成NO合成减少，进一步加重氧化应激对血管内皮的损伤。

目前研究多认为支架植入术后再狭窄的发生主要是因为内皮细胞大量增生[9]，在本实验中，镍钛合金支架植入后，LDL的穿胞量增加，可能是支架作用损伤内皮细胞所致。研究表明，血管内皮细胞受损会导致过多的LDL经过受体介导迁入内皮下被氧化，形成氧化修饰的低密度脂蛋白，巨噬细胞及平滑肌细胞吞噬ox-LDL后形成泡沫细胞，同时合并血管炎症、纤维增殖等反应，在病理学上表现为脂纹、粥样斑块和纤维斑块形成，促进了AS的发展，并诱发新的AS病变形成[5，10]。我们推测，ISR的原因不仅是内皮细胞的增生，支架植入后对局部血管粥样硬化病理进程的诱发和促进也是可能的原因之一。

针对支架作用并损伤内皮细胞可能发生的机制，我们尝试使用镍钛合金支架组及空白对照组作用于HUVEC，培养3 h及24 h后收集细胞，使用Western-blot技术检测实验组及对照组cavoline-1及eNOS的表达情况，暂未得出稳定阳性结果，仍需多次重复并改进实验。

本实验均为体外镍钛合金支架直接作用于HUVEC，尚需镍钛合金支架作用动物实验进一步证实和了解支架植入后的粥样硬化病理进程。我们期待，通过实验研究揭示粥样硬化在支架植入术后再狭窄中可能的机制及应对策略，为介入治疗血管闭塞性疾病提供新的视角和策略。

1 Sprague EA. In vivo cardiovascular assays for drug discovery: evolution of the drug-eluting stent[J]. Curr Opin Investig Drugs, 2007,8(3):219-225.

2 Philippe F, Dibie A, Larrazet F, et al. Drug eluting stents:from evidence based medicine to clinical practice[J]. Ann Cardiol Angiol, 2005, 54(4): 201-211.

3 Mauri L, Hsieh WH, Massaro JM, et al. Stent thrombosis in randomized clinical trials of drug-eluting stents[J]. N Engl J Med, 2007, 356(10):1020-1029.

4 Lei YP, Chen HW, Sheen LY, et al. Diallyl disulfde and diallyl trisulfde suppress oxidized LDL-induced vascular cell adhesion molecule and E-selectin expression through protein kinase A-and B-dependent signaling pathways[J]. J Nutr, 2008, 138(6):996-1003.

5 Keaney JF Jr. Atherosclerosis: from lesion formation to plaque activation and endothelial dysfunction[J]. Molecular Aspects of Medicine, 2000, 21(4-5):99-166．

6 van Beusekom HM, Whelan DM, Hofma SH, et al. Long-term endothelial dysfunction is more pronounced after stenting than after balloon angioplasty in porcine coronary arteries[J]. J Am Coll Cardiol, 1998, 32(4):1109-1117.

7 Bian F, Yang X, Zhou F, et al. CRP promotes atherosclerosis by increasing LDL transcytosis across endothelial cells[J]. Br J Pharmacol, 2014, 171(10):2671-2684.

8 Biff W.L, Moore EE, Moore FA, et al. Nitric oxide reduces endothelial expression of intercellular adhesion molecule (ICAM)-1[J]. J Surg Res, 1996,63(1):328-32.

9 Chandrasekar B, Mummidis S, Mahimainathan L, et al. Interleukin-18-included human coronary artery smooth muscle cell migration is dependent on NF-kappaB-and AP-1-mediated matrix metalloproteinase-9 expression and is inhibited by atorvastatin[J]. J Biol Chem, 2006, 281(22):15099-15109.

10 Goldschmidt-Clermont PJ, Greager MA, Losordo DW et a1. Atherosclerosis 2005 Recent Discoveries and Novel Hypotheses[J]. Circulation, 2005, 112(21):3348-3353.

Prliminary study of effects of Ni-Ti alloy stent on the low density lipoprotein transcytosis process

Tao Ran,Xiong Bin, Zheng Chuansheng, Liang Ming, Wang Qi, Zeng Jun. Department of Radiology, Union Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430022, China Corresponding author: Xiong Bin, Email: herrxiong@126.com

Objective To explore the effects of Ni-Ti alloy stent on the low density lipoprotein (LDL) transcytosis process in human umbilical vein endothelial cell (HUVEC) and underlying mechanism. Methods①Culturing the HUVEC and use transwell to establish in vitro transcytosis model, simulating the endothelial cell monolayer of blood vessels. ②Puting the Ni-Ti alloy stent on the HUVEC, adding LDL labeled by fuorescein isothiocyanate (FITC), culturing for 4 h and 24 h. ③By measuring the fuorescencent intensity of FITC in and out of the chamber to refect the changes of transcytosis of LDL, investigating the effect of the Ni-Ti alloy stent on the LDL transcytosis process. Results The Ni-Ti alloy stent increase the transcytosis in 3 h and 24 h. Conclusions Using the trancytosis model constituted by LDL and HUVEC, Ni-Ti alloy stent can promote the trancytosis of LDL.

Low density lipoprotein; Stents; Human umbilical vein endothelial cell (HUVEC); Transcytosis

2013-11-4）

（本文编辑：黄强）

10.3877/cma.j.issn.2095-5782.2014.02.001

武汉市应用基础研究计划项目（2014060101010038）

430022 武汉，华中科技大学同济医学院附属协和医院放射科

熊斌，Email：herrxiong@126.com