荧光定量PCR检测HBV－DNA、HCV－RNA室内质控物的制备及评估

葛咏梅，冯晓朦，周劲松，高 申＊

荧光定量PCR检测HBV－DNA、HCV－RNA室内质控物的制备及评估

葛咏梅1，冯晓朦2，周劲松2，高 申2＊

（1.吉林省人民医院，吉林长春130021；2.吉林大学中日联谊医院）

荧光定量PCR法检测人血浆中乙肝HBVDNA、HCV－RNA具有较高的灵敏度和较强的特异性［1］，但是检测的结果易受很多因素影响，因此严格的室内质量控制才能预防和控制检验误差，保证结果的准确性。目前，PCR检测试剂盒并未提供定值的室内质控品，且商用质控品的价格昂贵、不易获得，给常规PCR检测过程中室内质量控制带来不便。根据卫生部临检中心对质控品的相关规定，结合近年来临床PCR工作的基础，我们应用混合血清自制单一模式的混合血清实验室室内质控品，并根据《体外诊断试剂注册管理办法》（试行）等相关文件要求对其准确性、稳定性进行了初步评价，报告如下。

1 材料与方法

1.1标本采集

2012年6月—11月在我院住院和门诊患者血清中，分别选取60例HBsAg、HBeAg、抗HBc阳性、60例Hcv－Ab阳性的患者标本，选取200例乙肝、丙肝标志物均阴性的患者标本，所选取的标本均无黄疸、溶血、脂血、高IgG。

收集的阳性标本于56℃水浴箱中30min灭活，离心后收集上层血清，0.5ml／支分装，于－70℃冰箱中保存待测，避免反复冻融。

1.2主要仪器与试剂

LightCycler480荧光PCR基因扩增检测仪，深圳匹基生物工程有限公司的HBV－DNA、HCVRNA荧光定量PCR试剂盒。

1.3单一模式混合血清的制备

200例乙肝标志物均阴性标本的混合血清，作为基质血清；60例HBsAg、HBeAg、抗HBc均阳性标本的混合血清，记做模式①，60例Hcv－Ab阳性标本的混合血清，记做模式②。将模式①，模式②的病毒浓度测定3－4次，取其平均值。用基质血清通过1∶10、1∶100、1∶1000稀释后，检测3－4次，平均值及预期靶值。0.5ml／支分装，于－70℃冰箱中保存备用。

1.4确定靶值绘制质控图

使用相同的仪器及同一品牌的试剂盒在同一反应条件下进行检测，每次平行测定3个反应，连续检测20日，确定其靶值，计算x—、s、CV，并绘制质控图。

1.5均一性实验

任意抽取样本各30支，进行编号。从每支样本中取200μl，共6ml充分混匀，用于批内不精密度的检测，共检测30次。1－30号样本分别进行检测，每份样本检测1次，计算测定（总）不精密度。该检测为同一人操作，同一条件下，1次上机完成［2］。

1.6稳定性实验

1.6.1 分别取样本各20支共40支，分为4组，每组10支包括5支HBV－DNA、5支HCV－RNA，分别按照以下放置样本条件放置。放置条件：①室温（20－25℃），相对湿度20%－50%，3d；②冰箱冷藏（2－8℃），5d；③－20℃14d；④－70℃（不同条件下稳定性对照组）。

1.6.2 随机抽取20支样本－20℃冻存，12个月内不定期检测，每次抽取2支，复融，室温放置15 min，漩涡振荡混匀。每份样本从核酸提取开始平行做2份。以－70℃冻存的样本作为长期保存稳定性对照组，与－20℃保存时的检测值作比较，监测制备物长期保存时HBV DNA的含量变化。

1.7质控品的评估

1.7.1 生物安全性 在本实验制备前，将所用血清均按照常规方法进行56℃30min灭活备用，保证质控血清无已知的生物传染性。

1.7.2 质控品的准确性 本实验室为国家标准实验室，在常规工作条件下，由熟练的技术人员对自制的质控血清进行检测，经卫生部临检中心颁布的国家标准品溯源定值，结果一致。

1.8统计分析

按文献［3］方法计算x—、s、CV值。均一性实验检测采用方差齐性检验，稳定性试验检测采用t检验。

2 结果

2.1质控品的预期靶值

使用基质血清稀释的室内质控物的预期靶值见表1。

表1 最佳稀释倍数下所测得的HBV－DNA、HCV－RNA拷贝数

2.2质控品定值

在常规条件下，由熟练的技术人员对自制的质控血清进行检测20次，计算x—、s、CV值，确定质控品的预期靶值，详见表2。

表2 自制质控品参数

2.3均一性实验检测

对混合样本检测30次的数据和30份样本的检测数据进行统计，将两组数据作方差齐性检验，批内精密度和总精密度差异无统计学意义（F（HBV）＝1.0250、F（HCV）＝1.0240，P值均＞0.05），符合均匀性要求（表3）。

表3 均一性实验结果

2.4稳定性实验结果

不同条件下放置质控物结果P值均＞0.05，差异无统计学意义（表4）。对质控物的稳定性进行长期监测，12个月不定期分别对制备物HBV－DNA、 HCV－RNA监测12次，各组间t（HBV－DNA）＝0.949，t（HCV－RNA）＝0.926，P均＞0.05，无统计学差异，表明该定值制备物长期保存含量无明显变化。具有很好的稳定性和长期保存性（表5）。

表4 不同条件下放置质控物结果

表5 不定期检测HBV－DNA、HCV－RNA拷贝数

3 讨论

病毒性肝炎严重威胁人类健康，尤其是乙型肝炎在我国流行广泛，因此肝炎的诊断和治疗显得格外重要。目前临床实验室多采用荧光定量PCR方法检测，提高HBV－DNA、HCV－RNA荧光定量PCR检测的灵敏度与精确度，对临床乙型肝炎的诊断及预后有极其重要的用。

为了保证荧光定量PCR法进行病毒DNA定量检测的准确性，应严格按照实验室标准操作程序（SOP），建立和完善室内质控物，提高常规工作的批内、批间标本的一致性。

理想的室内质控样本的条件为：基质与待测标本一致，所含待测物浓度应接近试验的决定水平，有很好的稳定性，靶值或预期结果已定，无已知的生物传染危险性，单批可大量获得［4］。

本研究自制的质控品为单一模式的混合血清，且在实验前经过常规灭活，达到无生物传染性，并在通过国家标准的实验室条件下，由熟练的技术员进行荧光定量PCR检测，该定值质控品的测量准确度不低于国家标准、行业标准的规定，具有可信度。均一性实验结果显示，批内精密度和总精密度差异无统计学意义；稳定性实验结果表明，自制血清稳定，且长期保存含量无明显变化，达到国家对质控品制备要求的相关规定。且根据《分子诊断项目分析性能标准》自建检测系统不精密度要求：以能力验证／室间质评评价界限（靶值±0.4对数值）作为允许总误差（TEa），重复性精密度＜3／5TEa；中间精密度＜4／5TEa。按照项目稳定性要求选取最长期限样品，5个样品，覆盖测量区间，至少4个样品测量结果偏倚＜±7.5%，本质控品均达到要求。

因此通过本实验方法自制荧光定量PCR检测HBV－DNA、HCV－RNA的室内质控物，实验室的质量控制提供了基本的保障，也节约了实验室的成本。应用于临床乙型、丙型肝炎的检测的室内质控，为临床出具更多及时、准确的检验报告，具有很大的意义。

［1］H o SK，Yam WC，Leung EK，et al.Raped quantification of hepatitisB virus DNA by real－time PCR using fluorescent hybrid ization probes［J］.J Med Microbiol，2003，52：397.

［2］王露楠，邓 巍，申子瑜，等.乙型肝炎病毒DNA标准物质的研究［J］.中华肝脏病杂志，2007，15（2）：107.

［3］CNAS－GL26：2008.中国合格评定国家认可委员会.医学实验室质量和能力认可准则在基因扩增检验领域的指南［S］.

［4］李金明.实时荧光PCR技术［M］.北京：人民军医出版社，2007：190.

2014－01－17）

1007－4287（2014）12－2024－03

＊通讯作者