NINJ2基因功能单核苷酸多态性与脑梗死的相关性研究

冼文川，李新梅，朱薇薇

NINJ2基因功能单核苷酸多态性与脑梗死的相关性研究

冼文川1＊，李新梅2，朱薇薇2

（1.广东医学院附属医院神经内科，广东湛江524001；2.湛江中心人民医院神经内科，广东湛江524001）

目的分析粤西地区汉族人群NINJ2基因功能单核苷酸多态性（Functional SNP，F－SNP）与脑梗死的关联性。方法采用FASTSNP软件筛选神经损伤诱导蛋白基因2（NINJ2）的F－SNPs（rs34578646A／G和rs3809263A／G）。联合聚合酶链反应－限制性片段长度多态性（PCR－RFLP）和等位基因特异性PCR（AS－PCR）方法，对278例脑梗死患者（病例组）和120例正常对照者（对照组）进行F－SNPs基因型检测。结果病例组rs34578646A／G和rs3809263A／G的基因型频率和等位基因频率与对照组相比较差异无统计学意义（P＞0.05）。结论粤西地区汉族人群NINJ2基因功能单核苷酸多态性rs34578646A／G以及rs3809263A／G与脑梗死无关。

NINJ2基因；脑梗死；功能单核苷酸多态性

（Chin J Lab Diagn，2014，18：1996）

脑梗死是一种复杂的多因素疾病，多种环境因素和遗传因素在其发病过程中相互作用。Ikram的研究提示位于染色体12p13上NINJ2基因的单核苷酸多态位点（SNPs）与脑梗死有关，但国内外国外研究结论并不一致［1，2］。本研究拟通过运用SNP功能分析（snp functional analysis）的方法来探讨NINJ2基因功能单核苷酸多态性（（FunctionalSNP，F－SNP）与粤西地区汉族人脑梗死的相关性。

1 资料与方法

1.1病例与分组

病例组为我院2012年7月至2013年3月住院的患者，为粤西地区汉族人，共278例，均符合1995年全国第四次脑血管病学术会议制定的脑梗死标准，并经头部CT和（或）磁共振成像（MRI）确诊。对照组为同期在我院健康体检者，为粤西地区汉族人，共120例，排除脑血管病、冠心病、糖尿病、肝、肾、血液、自身免疫性疾病者。病例组缺血性脑卒中患者与对照组健康人群一般资料（性别、年龄、例数等）具有临床可比性（P＞0.05）。

1.2方法

1.2.1 相关多态性位点的筛选 根据文献［4］采用FASTSNP软件筛选NINJ2的功能单核苷酸多态性（F－SNPs）。本研究中纳入两个位点，一个是位于编码区的rs 34578646A／G，功能效应风险分值为2－3分，其可能的生物学效应为“在一个含有相同的蛋白质结构域的编码序列中，打破外显子剪接增强子或沉默子的结合位点”。另一个是位于5’－端上游非编码区的rs3809263A／G，功能效应风险分值为1－3分，其可能的生物学效应为“不改变一个氨基酸，但可以影响一个基因的表达水平，地点或时间”。1.2.2 DNA的提取 抽取早晨空腹肘部静脉血2 ml至含有EDTA－K2的抗凝试管，用溶液法（TIANamp Blood DNA System，北京天根生化科技有限公司）提取外周血白细胞的基因组DNA，将提取后剩下的血标本保存在－20℃。

1.2.3 DNA扩增 rs34578646A／G：采用等位基因特异性PCR（AS－PCR）法检测，上游引物为：a1 5’TGTGCTTTCTCCCCTACAGCCTGGA’3a2 5’TATATGTGCTTTCTCCCCTACAGCCTGGG’3下游引物为：b 5’CAGGGTGGTGTAGTAGTGAGA＇3。PCR扩增：94℃预变性5min后，94℃45 s，53℃退火45s，72℃延伸90s，34个循环后再于72℃延伸10min。

rs3809263A／G：采用聚合酶链反应－限制性酶切片段长度多态性（PCR－RFLP）法检测，引物为：上游5’TTGAATGTGGTGAGGGTA’3，下游5’GGAGCAGGGAGTAGTTGT’3。PCR扩增：94℃预变性5min后，94℃变性30s，60.5℃退火30s，72℃延伸60s，30个循环后再于72℃延伸10min。1.2.4 PCR扩增产物酶切及基因型分析rs34578646A／G位点PCR扩增后，拥有一条194 bp碱基片段的为AA型纯合子；拥有一条198bp碱基片段的为GG型纯合子；拥有194bp、198bp两条碱基片段的为AG型杂合子。

rs3809263A／G位点的扩增片段长度为316 bp，经限制性内切酶HpaI消化后拥有316bp、83 bp和233bp三条碱基片段的为AG型杂合子；拥有83bp和233bp两条碱基片段的为GG型纯合子；拥有一条316bp碱基片段的为AA型纯合子。1.2.5 统计学分析 应用SPSS19.0统计软件包和遗传学数理统计方法进行统计分析。计算各组基因型和等位基因频率，Hardy－Weinburg平衡吻合度和基因型频率统计分析采用χ2检验，统计学显著性定为P＜0.05。

2 结果

2.1 病例组rs34578646A／的基因型与等位基因频率与对照组相比较差异无统计学意义（χ2＝0.249，P＝0.617）（见表1）。

表1 rs34578646 A／G多态性基因型频率及等位基因频率

2.2 病例组rs3809263A／G的基因型与等位基因频率与对照组相比较差异无统计学意义（χ2＝ 0.394，P＝0.530）（见表2）。

表2 rs3809263 A／G多态性基因型频率及等位基因频率

3 讨论

NINJ2基因位于染色体12p13.33，包括4个外显子和3个内含子，编码由142个氨基酸组成的约20KDa的蛋白质，即为神经损伤诱导蛋白2（ninjurin2）。初步研究提示ninjurin2可表达于神经系统，周围神经损害可诱导施万细胞上调表达该蛋白以促进神经突生长和神经再生，在中枢神经系统内ninjurin2的表达水平可能会影响脑部对缺血现象的耐受度［5］。

SNP功能分析（SNP functional analysis）是指对基因产物有影响的SNP（Functional SNP，FSNP）进行功能分析，可以为复杂疾病的大规模直接关联分析法提供大量可靠的候选SNP标记，加快复杂疾病的致病基因定位的研究速度。既往对基因与疾病关系的研究主要集中在基因的编码区。近年SNP数据的快速积累使得用计算方法对编码区和非编码区SNP进行功能分析成为可能［4］。

在本研究中，位于NINJ2基因编码区Exon2的F－SNPs rs34578646与粤西地区汉族人群缺血性脑卒中无关联。国内Wan XH等［6］研究显示，位于NINJ2编码区Intron1的rs10849373位点与中国人群缺血性卒中有关，而分别位于Exon1与Exon4的rs4980959与rs2245906这两个位点与中国人群缺血性卒中无关，本研究结果与之类似。其原因可能是因为NINJ2基因Intron1的长度（97.1kB）比其他外显子及内含子长得多（其他内含子及外显子的长度由0.185kB到0.548kB不等），可能含有许多的转录调控转录的元素，如增强子和沉默子，从而在基因转录调控中发挥重要作用，这需要进一步的探索。

在本研究中，位于NINJ2基因5’－端上游非编码区的rs3809263与粤西地区汉族人群缺血性脑卒中无关联。Van等的研究提示NINJ2基因5’上游非编码区两个SNP，rs11833579和rs12425791的多态性与荷兰人脑卒中的大血管病变有关［7］，但国内尚贤金等发现rs11833579GG基因型和G等位基因与福建地区汉族人动脉粥样硬化型脑梗死发病无关联［8］，本研究结果和尚贤金等相似。目前国际上多个研究结果不尽一致，究其原因可能是因为复杂疾病的易感基因往往受到特定种群遗传结构的影响，同时样本数上存在差异很大，可能对结果也有一定的影响。

综上所述，在本研究中，我们发现NINJ2基因的功能单核苷酸多态性位点rs 34578646、rs3809263与中国粤西地区汉族人的脑梗死无关。NINJ2基因功能单核苷酸多态性与脑梗塞的相关性还需要进一步行大样本，多中心的研究证实。

［1］Ikram MA，Seshadri S，Bis JC，et al.Genome－wide association studies of stroke［J］.N Engl J Med，2009，360（17）：1718.

［2］陈 廓，肖占森，侯淑琴，等.NINJ2基因多态性与房山地区汉族脑卒中易感强相关［J］.北京大学学报（医学版），2010，42（5）：498.

［3］Matsushita T，Umeno J，Hirakawa Y，et al.Association study of the polymorphisms on chromosome 12p13with atherothrombotic stroke in the Japanese population［J］.J Hum Genet，2010，55（7）：473.

［4］Hsiang－Yu Yuan，Jen－Jie Chiou，Wen－Hsien Tseng et al.FASTSNP：an always up－to－date and extendable service for SNP function analysis and prioritization［J］.Nucleic Acids Res，2006，34：635.

［5］Araki T，Milbrandt J.Ninjurin2，a novel homophilic adhesion molecule，is expressed in mature sensory and enteric neurons and promotes neurite outgrowth［J］.Neurosci，2000，20（1）：187.

［6］Wan XH，Li SJ，Cheng P，et al.NINJ2polymorphism is associated with ischemic stroke in Chinese Han population［J］.Neurol Sci，2011，308（1－2）：67.

［7］van den Herik，Evita G，de Lau，et al.Association of two single nucleotide polymorphisms from genomewide association studies with clinical phenotypes of cerebral ischemia［J］.Int J Stroke，2011，7（5）：219.

［8］尚贤金，王 柠，吴志英.染色体12p13两基因间多态与脑梗死的关联研究.［学位论文］.福建医科大学学报，2011，11（5）：185.

The Association of NINJ2 gene Functional single－nucleotide polymorphisms with Cerebral Infarction

XIAN Wen－chuan1，LI Xin－mei2，ZHU Wei－wei2.（1.Department of Neurology，Affiliated Hospital of Guangdong Medical College；2.Department of Neurology，Central People’s Hospital of Zhanjiang，Zhanjiang524001，China）

ObjectiveTo investigate the relationship between cerebral infarction（CI）and the functional single nucleotide polymorphisms（F－SNPs）of NINJ2gene in Han population of the Western Guangdong province in China.MethodsThe F－SNPs of NINJ2gene（rs34578646A／G and rs3809263A／G）was screened by FASTSNP software.Genotype and allele frequency was analysis in 278cerebral infarction cases and 120healthy controls.ResultsThe frequencies of genotypes and allele in two polymorphisms（rs34578646A／G and rs3809263A／G）showed an insignificant difference between case and control groups（P＞0.05）.ConclusionTwo F－SNPs of NINJ2gene（rs34578646A／G and rs3809263A／G）were not associated with the risk of ischemic stroke.

NINJ2gene；cerebral infarction；functional single nucleotide polymorphisms（F－SNPs）

R743

：A

2014－01－15）

1007－4287（2014）12－1996－03

2012年湛江市科技攻关计划项目编号：2012C3102024

＊通讯作者