婴儿配方乳粉中甘油三脂Sn-2脂肪酸的测定

贾云虹，李朝旭，房新平，杨凯

（河北三元食品有限公司研发部，河北石家庄050071）

母乳是婴儿成长最好的食物，但是，因各种原因不能母乳喂养或母乳供应不足以及婴儿在6个月以后和断奶期需要增加辅食的情况下，婴幼儿配方乳粉成为可供选择的最佳食品之一。婴幼儿配方乳粉从开始研究至今已有近100年的历史，其研制进程也逐渐由宏观调整走向了微观调整。脂肪作为婴幼儿配方乳粉中的重要营养素，也正经历着由脂肪酸组成接近到脂肪结构接近母乳，向无限趋近母乳的方向更进了一步[1]。从宏观上看，作为婴幼儿配方乳粉重要原料的牛乳和人乳的脂肪含量相近，但从微观上看，它们的脂肪酸位置分布却有着很大的差异。

人乳中最重要的饱和脂肪酸—棕榈酸，大约有70%是酯化在甘油三酯分子2-位上。而牛乳以及绝大多数市场上销售的婴幼儿配方奶粉中所用的植物油脂里的棕榈酸则是连在1-或3-位上（2-位上的量少于20%）[2-5]。这种甘油三酯中的棕榈酸会在小肠内被胰酯酶水解，形成游离态脂肪酸，并与钙元素结合生成钙皂，造成婴幼儿体内存在大量供能物质——棕榈酸以及钙元素的流失[5]。所以，世界各大婴幼儿乳粉生产企业都在研究如何进一步调整配方乳粉中2-位棕榈酸的含量，以使以牛乳为基础原料的婴幼儿配方乳粉更加适合宝宝食用，但在婴幼儿配方乳粉中2-位脂肪酸的检测上国内的研究还很少。

国外对甘油三酯脂肪酸位置分布的研究已经很多，但基本步骤都是采用酶或化学试剂对甘油三酯进行部分水解，然后用操作复杂、费时费力的薄层色谱法（TLC）分离纯化2-位单甘脂，直接或衍生后用气相色谱（GC）测定[6-7]。国内，GB/T 24894-2010《动植物油脂甘三脂分子2-位脂肪酸组分的测定》对动植物油脂2-位脂肪酸组分的测定进行了规定[8]，也是采用TLC法对2-位单甘脂进行分离；赵海珍等采用高效液相色谱法对猪油甘油三酯的脂肪酸位置分布进行了测定，但2-位上的脂肪酸组成是通过间接方式计算而得，影响了结果的准确性[9]。这些方法多是用于动植物油脂的甘油三酯脂肪酸组成的测定，对婴幼儿乳粉脂肪中甘油三酯2-位脂肪酸组成测定的报道很少。

本研究用反相高效液相色谱法（RP-HPLC）代替传统的TLC法分离纯化婴儿配方乳粉脂肪中2-位单甘酯，对单甘酯进行甲酯化衍生后，用气相色谱仪分析2-位脂肪酸组成和含量。

1 材料与方法

1.1 材料

棕榈酸甘油一酯（99%）、棕榈酸甘油二酯（≥99%）、棕榈酸甘油三酯（99%）、棕榈酸（≥99%）、37种脂肪酸甲酯标准品（10 mg/mL）、猪胰脂酶：sigma公司；正己烷、乙腈、甲醇、二氯甲烷、色谱纯；其余试剂为分析纯。三羟甲基氨基甲烷缓冲溶液：1 mol/L，用6 mol/L盐酸调至pH=8；胆酸钠溶液：1 g/L；氯化钙溶液：220 g/L。

1.2 设备

Agilent 1100高效液相色谱系统：配有蒸发光散射检测器和馏分收集系统，美国安捷伦公司；Agilent 7890气相色谱仪：配有FID检测器，美国安捷伦公司；SP-2560气相色谱柱：西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司；氨基色谱柱：大连依利特公司；RE-52型旋转蒸发仪：上海博通化学科技有限公司；DSY-Ⅲ氮吹仪：北京东方精华苑科技有限公司；恒温水浴锅：余姚市东方电工仪器厂；XW-80A涡旋振荡器：上海精科实业有限公司；TDL-5离心机：上海安亭科学仪器厂。

1.3 方法

1.3.1 乳粉脂肪的提取

采用ISO14156（IDF172）规定的方法提取乳脂肪[10]。

1.3.2 乳脂肪甘油三酯1、3位脂肪酸的水解

称取0.1 g试样于10 mL离心管中，加入约30 mg脂肪酶和2 mL缓冲溶液，小心摇动，然后加入0.5 mL胆酸钠溶液和0.2 mL氯化钙溶液，盖上塞子小心摇动，立即将离心管放入40℃水浴锅中，保持手摇（60±2）s。从水浴锅中取出离心管，在40℃下，用振荡器剧烈震荡（120±2）s。立即加入1 mL盐酸和1 mL二氯甲烷，用振荡器剧烈震荡。离心分离，用注射器将有机层转移，并用0.45 μm滤膜过滤到液相色谱样品瓶中备用。

1.3.3 液相色谱分离制备单甘脂

1.3.3.1 色谱条件

流动相：乙腈（含0.1%冰乙酸）∶二氯甲烷=50∶50；色谱柱：氨基柱 4.6 mm×250 mm，5 μm；柱温：40 ℃；流速：1 mL/min；蒸发光散射检测器：漂移管70℃，雾化气压力：0.3 MPa。

1.3.3.2 色谱分离单甘脂

注入40 μL单甘脂标准品于液相色谱仪，确定单甘脂的保留时间，然后 注入40 μL样品于液相色谱仪，根据单甘脂保留时间收集单甘脂馏分。

1.3.4 单甘脂甲酯化

将收集的单甘脂用氮吹仪吹干，加入1 mL正己烷溶解，加入0.2 mL氢氧化钾甲醇（2 mol/L）溶液，剧烈震摇2 min，静置分层，将正己烷层转移至气相色谱样品瓶。

1.3.5 气相色谱分析2-位脂肪酸

分别注入1 μL脂肪酸甲酯标准品和1 μL样品于气相色谱仪，根据37种脂肪酸标准品的保留时间定性样品中各脂肪酸，用色谱峰面积归一法定量。气相色谱条件：参考GB 5413.27-2010《婴幼儿食品和乳品中脂肪酸的测定》[11]。

2 结果与讨论

2.1 乳粉脂肪提取方法的选择

分别采用罗兹哥特里法、酸水解法、氯仿甲醇法和ISO14156（IDF172）规定的方法提取乳粉中的脂肪，结果发现罗兹哥特里法、酸水解法、氯仿甲醇法不但操作过程繁琐，而且脂肪提取量少，不利于下一步的分析使用，而ISO14156《乳和乳制品中脂肪和脂溶性物质的提取方法》，操作省时、简便，提取的脂肪量大，便于下一步的分析。

2.2 液相色谱分离制备单甘脂条件的确定

2.2.1 色谱柱的选择

分别采用正相硅胶柱和反相C18柱、氨基柱分离棕榈酸甘油一酯、棕榈酸甘油二酯、棕榈酸甘油三酯、棕榈酸四种标准品的混合样品。实验发现用正相硅胶柱分离，灵敏度低，分析时间长，而且杂峰干扰较多；用反相C18色谱柱，单甘脂和棕榈酸保留时间较近，不能完全分离，这样在制备时，棕榈酸就会对单甘脂造成干扰，使收集的单甘脂不纯；而使用氨基柱分离，单甘脂与其它色谱峰保留时间相隔都较远，能有效的制备出纯的单甘脂，色谱图见图1。

2.2.2 流动相对色谱分离的影响2.2.2.1冰乙酸的影响

冰乙酸对脂肪酸有较大影响，冰乙酸含量少会造成脂肪酸拖尾，同时灵敏度低，脂肪酸含量大，造成保留时间长，另外在蒸发光散射检测器雾化时不易气化，造成基线噪音增大，影响灵敏度，通过比较试验，选择0.1%（体积分数）的冰乙酸乙腈溶液作为流动相的A相，能得到较好的效果。

2.2.2.2 二氯甲烷的影响

当流动相中二氯甲烷的比例增加时，各色谱峰保留时间延长，各甘油酯和脂肪酸分离更好，但会降低脂肪酸的灵敏度，而且会使分析时间延长，当流动相中二氯甲烷的比例减少时，各色谱峰保留时间有所提前，但造成色谱峰重叠，不能很好分离，实验对比了流动相中乙腈（含0.1%冰乙酸）：二氯甲烷比例分别为90∶10、70∶30、50∶50、40∶60、30∶70 时的分离效果，发现二者的比例为50∶50时，既能分离得较好，又能节省分析时间，也有较好的灵敏度，见图1。

图1 甘油酯和脂肪酸反相液相色谱分离谱图Fig.1 The chromatographic peak of glyceride and fatty acid

2.2.3 蒸发光散射检测器漂移管温度的确定

漂移管温度对检测器响应的影响随温度升高，流动相蒸发趋向完全而信噪比上升，但温度过高，可能导致组分部分气化而使信号变小，分别设定了50、60、70、80、90℃进行实验，结果表明70℃时，信噪比最好，基线平稳，能得到很好的效果。

2.3 胰脂酶用量的确定

在提取的乳脂中分别加入20、30、40 mg胰脂酶，进行水解后，按照已经确定的色谱条件注入液相色谱仪观察水解效果，结果发现加入20、30 mg胰脂酶的样品，单甘脂能和其他色谱峰完全分离，见图2、3，加入40 mg胰脂酶的样品，单甘脂的峰和后面的峰连在一起，不能分离，见图4，这是由于加入的酶量大，水解出来的单甘脂和脂肪酸多，导致色谱峰变宽。为了得到最大的制备量和最好的分离效果，因此选择胰脂酶的用量为30 mg。

2.4 单甘脂甲酯化方法的选择

图2 20 mg胰脂酶单甘脂分离色谱图Fig.2 The chromatographic peak of monoglyceride（20 mg pancreatic lipase）

图3 30 mg胰脂酶单甘脂分离色谱图Fig.3 The chromatographic peak of monoglyceride（30 mg pancreatic lipase）

图4 40 mg胰脂酶单甘脂分离色谱图Fig.4 The chromatographic peak of monoglyceride（40 mg pancreatic lipase）

油脂的甲酯化方法有三氟化硼法、三甲基氢氧化硫法、酯交换法、乙酰氯法等。三氟化硼法、乙酰氯法和三甲基氢氧化硫法操作繁琐，而且所用药品三氟化硼、三甲基氢氧化硫甲醇和乙酰氯甲醇有毒，不利于人体健康，而酯交换法是加入氢氧化钾溶液通过酯交换甲酯化，操作简便易行、快速，省时省力，能得到理想的结果，因此选择酯交换法作为单甘脂的甲酯化方法。气相色谱分析脂肪酸甲酯色谱图见图5。

2.5 方法重现性试验

取同一婴儿配方奶粉，分别采用本研究所述方法对2-位脂肪酸进行6次测定，2-位棕榈酸、油酸、亚油酸结果如表1。

从表1可以看出，测定结果重现性较好，RSD都在5%以下，三种脂肪酸中棕榈酸的RSD最好，测定结果较为稳定。

图5 2-位脂肪酸气相色谱分析谱图Fig.5 The chromatographic peak of fatty acids in the 2-positions

表1 2-位脂肪酸重现性结果Table 1 The result of repeatability of fatty acids in the 2-position

2.6 与薄层法分离单甘脂数据对比

同一婴儿配方乳粉，分别采用TLC和RP-HPLC法分离制备2-位单甘脂，甲酯化后注入气相色谱分析2-位棕榈酸含量，结果如表2。

表2 TLC法和RP-HPLC法数据对比Table 2 The comparison between TLC and RP-HPLC

从表2中数据可以看出，两种方法测定结果是一致的，但RP-HPLC法操作更简便、快捷，省时省力，所用设备先进、可靠，是现代分析技术的发展趋势。

2.7 实验室间数据对比

将4个奶粉样品送到中国检验检疫科学研究院综合检测中心检测2-位棕榈酸，同时在本实验室用薄层和液相两种方法制备单甘脂，检测2-位棕榈酸，结果如表3。从检测结果可以看出，中国检科院、本实验室薄层法分离单甘脂和液相色谱法分离单甘脂三种方法检测结果比较接近，用本方法检测2-位脂肪酸是比较准确可靠的。

3 结论

本文建立了一种用反相高效色谱法分离2-位单甘脂，气相色谱法分析2-位脂肪酸的婴儿配方乳粉中2-位脂肪酸的测定方法，用本方法测定婴儿配方乳粉中甘油三酯分子2-位脂肪酸含量，准确可靠，重现性好，2-位棕榈酸RSD为1.99%，油酸RSD为3.22%，亚油酸RSD为4.37%。并且方法简便、快捷，可以满足日常检测要求。

表3 2-位棕榈酸占总棕榈酸的比例Table 3 The proportion of 2-Position palmitic acid in total palmitic acid %

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[10]International Organization for Standardization(ISO）.14156 Milk and milk products-Extraction methods for lipids and liposoluble[S].Switzerland,2001-12-01

[11]中华人民共和国卫生部.GB5413.27-2010食品安全国家标准婴幼儿食品和乳品中脂肪酸的测定[S].北京:中国标准出版社,2010