加味参附颗粒对慢性心力衰竭大鼠心肌超微结构的影响*

靳利利 袁 丁 史振羽 姚 楠 王清海

（广东省第二中医院，广东 广州 510095）

加味参附颗粒对慢性心力衰竭大鼠心肌超微结构的影响*

靳利利 袁 丁 史振羽 姚 楠 王清海

（广东省第二中医院，广东 广州 510095）

目的建立大鼠心衰模型，观察加味参附颗粒对腹主动脉缩窄法造模成功的慢性心力衰竭大鼠模型的心肌线粒体Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶活性、血清TNF-α及IL-6的表达和超微结构的影响。方法雄性SD大鼠50只，随机分为正常组（不给药）、模型组（灌胃生理盐水）、曲美他嗪组（灌胃曲美他嗪5.4 mg/kg）、加味参附颗粒低剂量组（灌胃加味参附颗粒6.84 g/kg）、加味参附颗粒高剂量组（灌胃加味参附颗粒13.68 g/kg）各10只，采用腹主动脉缩窄法建立心衰模型。测定心肌线粒体Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶活性、血清TNF-α及IL-6的表达和电镜下观察心肌超微结构形态。结果加味参附颗粒高、低剂量均能够显著提高心衰大鼠心肌线粒体Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶活性，减轻心肌超微结构的损伤。结论加味参附颗粒对心衰大鼠超微结构有保护作用，其机制可能是通过慢性心衰心肌各细胞因子的表达具有重要的抑制效应，并通过调节心肌线粒体Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶活性发挥作用。

心力衰竭 加味参附颗粒 超微结构

慢性心力衰竭发病率高、死亡率高，为心血管科常见病和多发病，同时其发病率和患病率也在逐年增加。加味参附颗粒是本文作者之一王清海教授研制的中药复方制剂，临床用于防治心力衰竭，具有明显的临床疗效。为进一步阐明验方加味参附颗粒的作用机制，本课题组开展了加味参附颗粒对心力衰竭大鼠超微结构影响的实验研究，并观察对肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白细胞介素-6（IL-6）的影响以及探讨加味参附颗粒治疗慢心衰的部分可能机制。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SPF级SD大鼠，体质量180～220 g，由广东省医学实验动物中心提供，实验动物生产许可证号SCXK（粤）2008-0002，实验动物质量合格证号No.0100288。动物实验环境：广东省中医研究所SPF级动物实验室，设施使用许可证号SYXK （粤）2010-0059。

1.2 药物 加味参附颗粒由红参、附子、茯苓、葶苈子等药物组成（广东省第二中医院制剂室生产，粤药制字Z20071343，批号20120201）使用时溶于生理盐水中，混匀后用于动物灌胃。曲美他嗪片 （山东瑞阳有限公司，国药准字H20066534）。每次灌胃前将药物研磨粉碎，再用蒸馏水稀释使用。

1.3 模型制备 随机分组为正常组、模型组、曲美他嗪组、加味参附颗粒低剂量组、加味参附颗粒高剂量组，每组10只。除正常组外，其余大鼠用氯胺酮（50 mg/kg）和地西泮（5 mg/kg）腹腔注射麻醉，麻醉后仰卧位固定，腹部剪毛、消毒，于腹部正中切开皮肤层，沿腹白线切开肌肉层。用生理盐水纱布遮盖创面，然后分离膈肌下肾动脉分支上的一小段腹主动脉，将棉线穿至腹主动脉下，选择直径1 mm软导管置于腹主动脉上，用棉线将动脉及导管结扎在一起至完全阻断血流后，抽出导管，结扎后的腹主动脉内径即为导管直径。缝合手术创面，消毒，腿部肌内注射青霉素，术后注意保暖，待动物完全清醒，送回动物房常规饲养。

1.4 给药方法 加味参附颗粒低剂量组每日灌服6.84 g生药/kg（等同于临床剂量），高剂量组每日灌服13.68 g生药/kg（等同于2倍临床效量），曲美他嗪组予每日灌服5.4 mg/kg，模型组给同体积的生理盐水。正常组不给药。给药8周。

1.5 标本采集与检测 （1）心肌线粒体Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶活性的测定。组织线粒体分离试剂盒，产品编号为C3606，碧云天生物技术研究所。根据每小时每毫克组织蛋白的组织中ATP酶分解ATP产生1 μmoL无机磷的量为一个ATP酶活力单位。计算公式：组织中ATPase活力=测定管OD值-对照管OD值/标准管OD值-空白管OD值×标准管浓度（0.02 μmol/mL）×6×7.8+待测匀浆蛋白浓度。（2）ELISA法检测血清TNF-α及IL-6的表达。麻醉后大鼠腹主动脉取血，干净促凝管中室温凝固30 min后1000 r/min离心15 min，收集血清并分装。按试剂盒说明书操作步骤进行。（3）心肌超微结构观察。随机抽取各组左心室缺血区心肌组织，做成切片，供心肌超微结构观察，每组1只。取各组大鼠左心室心肌组织，切成1 mm3大小，超微标本入3％戊二醛固定液固定2 h，1％锇酸固定1 h，逐级酒精、丙酮脱水后，环氧树脂包埋，超薄切片，经铀、铅双重染色后，送中山大学第一附属医院电镜室，1200E X透射电镜观测各组大鼠心肌超微结构变化。

1.6 统计学处理 应用SPSS15.0统计软件。计量资料以±s）表示，采用t检验、χ2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组心肌线粒体Na+-K+-ATP酶和Ca2+-ATP酶活性比较 见表1。结果示各治疗组血清TNF-α、IL-6的表达较模型组均明显降低，而模型组与正常组，加味参附颗粒高剂量组与加味参附颗粒低剂量组、曲美他嗪组相比差异均有统计学意义（均P＜0.05）。模型组中Na+-K+-ATP酶和Ca2+-ATP酶活性均较低，而曲美他嗪组、加味参附颗粒低剂量组及加味参附颗粒高剂量组较模型组明显升高（P＜0.05）；加味参附颗粒高剂量组与曲美他嗪组相近（P＞0.05）。

表1 各组Na+-K+-ATP酶和Ca2+-ATP酶活性比较（分，±s）

表1 各组Na+-K+-ATP酶和Ca2+-ATP酶活性比较（分，±s）

与模型组比较，*P＜0.05；与正常对照组相比，△P＜0.05；与加味参附颗粒高剂量组比较，▲P＜0.05。

组 别 n Na+-K+-ATP酶 Ca2+-ATP酶 TNF-α（ng/L） IL-6（ng/L）正常组 10 3.15±0.75* 1.76±0.39* 53.96±3.18* 352.40±87.20*模型组 10 2.23±0.48 0.66±0.63 420.36±67.57△3704.44±1048.81△曲美他嗪组 10 3.35±0.58* 1.13±0.56*105.86±4.03* 672.92±143.94*加味参附颗粒低剂量组 10 3.01±0.53*▲ 0.96±0.50*▲180.48±44.84*▲1783.60±130.04*▲加味参附颗粒高剂量组 10 3.30±0.63 1.12±0.498 108.64±0.50* 996.52±40.65*

2.2 各组心肌透射电镜观察结构情况 正常组：肌原纤维纵向走向，肌节结构明显，肌丝排列整齐，明暗带结构清楚，其间可见线粒体及肌浆网，线粒体排列较整齐，结构清楚，线粒体间可见少量脂滴，细胞核核膜清楚，可见核孔，无聚集成块、无空泡形成等现象。模型组：心肌肌原纤维排列较紊乱，肌节结构模糊，明暗带结构不清，心肌收缩带形成，线粒体增生，体积增大，压迫肌原纤维，线粒体形状大小不一，排列尚整齐，结构不清，部分溶解、断裂、核膜部分溶解、消失，边缘不规则，部分线粒体空泡形成等。曲美他嗪组：心肌肌原纤维排列较整齐，肌节结构较明显，明暗带较清楚，线粒体大多排列较整齐，结构较清楚，包膜完成，未见明显肿胀，未见溶解与断裂，线粒体间可见少量脂滴，细胞核核膜部分不清楚。加味参附颗粒组高、低剂量组：肌原纤维排列整齐，肌节结构明显，肌丝排列整齐，明暗带清楚，其间可见线粒体及肌浆网，线粒体排列较整齐，结构清楚，嵴结构清晰，未见肿胀，线粒体间可见少量脂滴，细胞核核膜较清楚，包膜完整，无结块及边集现象，无空泡形成，两图比较差异性不大。

3 讨论

Na+-K+-ATP酶（钠泵）和Ca2+-ATP酶是广泛存在于组织细胞及细胞器膜上的一种蛋白酶，可调节细胞内外Na+-K+梯度［1］，心室肌、心房肌和蒲肯耶纤维的这种跨膜梯度是形成动作电位去极相Na+内流和K+外流的动力，是形成细胞内钙稳态的基础。心肌细胞内Ca2+浓度是心肌维持正常生理功能的重要因素，心肌细胞Na+-K+-ATP酶受到抑制时，必然导致细胞内Na+升高，K+降低，Na+-Ca2+交换减少造成细胞内Ca2+增高，进而影响心肌的收缩力。Na+-K+-ATP酶和Ca2+-ATP酶活力的高低是细胞能量代谢及功能有无损伤的重要指标。

图1 心肌透射电镜图（×18500）

炎症细胞因子级联反应对于心衰的发生发展具有重要作用，可降低心肌收缩力及心输出量，促进自发性功能障碍、胰岛素抵抗、内皮损失及血液高凝状态等［2］。血清IL-6、TNF-α的水平与心血管危险因素患者病情严重程度密切相关［3］，可能通过下调肌浆网Ca2+-ATP酶，推迟舒张心肌细胞钙离子的再吸收和衰减，导致心脏舒张功能不全［4］。

本实验中，模型组Na+-K+-ATP酶和Ca2+-ATP酶活性均较低，而曲美他嗪组、加味参附颗粒低剂量组及加味参附颗粒高剂量组较模型组明显升高，加味参附颗粒与模型组差异显著，说明益气温阳、活血利水的加味参附颗粒治疗效果明显。实验进一步表明加味参附颗粒并降低血清中细胞因子TNF-α、IL-6的表达，说明益气温阳、活血通络中药复方制剂有效成分配伍对上述细胞因子的产生和表达有一定的抑制作用，且疗效优于单一用药组，与曲美他嗪功效相近。

同时本研究发现，经加味参附颗粒干预后的心衰大鼠的心肌纤维、线粒体等组织受到的破坏明显减少，肌原纤维排列整齐，肌节结构明显，肌丝排列整齐，明暗带清楚，其间可见线粒体及肌浆网，线粒体排列较整齐，结构清楚，嵴结构清晰，未见肿胀，线粒体间可见少量脂滴，细胞核核膜较清楚，包膜完整，无结块及边集现象，无空泡形成，说明加味参附颗粒在改善心肌超微结构方面优势亦较明显。

既往的研究也表明，加味参附颗粒不仅改善慢性心衰患者的临床症状，降低体循环外周阻力，减轻左心后负荷，增强心肌收缩力、提高心输出量有明显的功效，而且通过6 min步行实验的办法评价出改善患者心功能，改善预后，提高生活质量等方面亦疗效明显［5-7］。

本实验选择以心肌线粒体Na+-K+-ATP酶和Ca2+-ATP酶活性为观察指标，通过电镜观察加味参附颗粒对心衰大鼠心肌超微结构的影响，结果提示模型大鼠的Na+-K+-ATP酶和Ca2+-ATP酶活性明显下降，存在能量代谢异常，而经加味参附颗粒干预的心衰大鼠Na+-K+-ATP酶和Ca2+-ATP酶活性未见下降，并有一定程度的升高，提示加味参附颗粒可能通过提高心衰大鼠的心肌ATP酶来改善心衰大鼠的心肌能量代谢，进而对心肌的超微结构产生影响，这可能是加味参附颗粒治疗心衰的作用机制。故从阳虚血瘀水停-心肌超微结构角度探讨加味参附颗粒对心衰治疗的干预效应，开发中药有效成分配伍组成的新药，有望成为心衰治疗学研究的重要途径。

［1］Xie ZJ，Cail T.Na+-K+-ATP ase-Mediated Signal Transduction：from protein interaction to cellular function［J］.Mol Interv，2003，3（3）：157-168.

［2］Parish RC，Evans JD.Inflammation in chronic heart failure. Ann Pharmacother.2008 Jul，42（7）：1002-1016，273-286. Epub 2011 Jan 19.

［3］Meyer T，Stanske B，Kochen MM，et al.Elevated serum levels of interleukin-10 and tumor necrosis factor-α are both associated with vital exhaustion in patients with cardiovascular risk factors［J］.Psychosomatics，2010 May，51（3）：248-56. Erratum in：Psychosomatics，2011，52（1）：97-98.

［4］Wu CK，Lee JK，Chiang FT，et al.Plasma levels of tumor necrosis factor-α and interleukin-6 are associated with diastolic heart failure through down regulation of sarcoplasmic reticulum Ca2+-ATPase［J］.Crit Care Med，2011，May，39（5）：984-992.

［5］袁丁，靳利利，李典鸿，等.加味参附颗粒治疗慢性心力衰竭疗效分析［J］.吉林中医药，2011，31（7）：633-634.

［6］苏慧，靳利利，李典鸿，等.加味参附颗粒改善慢性心力衰竭患者生存质量的临床研究［J］.福建中医药，2011，42（5）：27-29.

［7］黄培红，靳利利，刘秋江，等.加味参附颗粒对慢性心力衰竭患者预后的影响［J］.福建中医药，2011，42（5）：19-20.

Ef fect of Jiaweishenfu Granule on Ultrastructure of M yocardium in Rats with Chronic Heart Failure

JIN Li-li，YUAN Ding，SHI Zhen-yu，et al. The Second TCM Hospital of Guangdong Province，Guangdong，Guangzhou 510095，China

Objective：To establish heart failure model of rats with chronic heart failure by abdominal aorta constriction and to observe the effect of Jiaweishenfu granule on myocardial mitochondria Na+-K+-ATP enzyme，activity of Ca2+-ATP enzyme，serum TNF-α and IL-6 expression，and ultrastructure.M ethods：50 male SD rats were randomly divided into normal control group，model group，Qumei trimetazidine group，low dose of Jiaweishenfu granule group，and high dose of Jiaweishenfu granule group，10 rats in each group.Rats with heart failure model were established by abdominal aortic coarctation method.Myocardial mitochondria Na+-K+-ATP enzyme，Ca2+-ATP enzyme activity，and expressions of serum TNF-α and IL-6 were determined.Ultrastructure under electron microscopic was observed.Results：low dose of Jiaweishenfu granule group can significantly improve activity of myocardial mitochondria Na+-K+-ATP enzyme and Ca2+-ATP enzyme，and reduce myocardial ultrastructure damage.Conclusion：Jiaweishenfu granule has a protective effect on ultrastructure of heart failure rats.It works by inhibiting expression of chronic heart failure cytokines，and by regulating activity of myocardial mitochondria Na+-K+-ATP enzyme and Ca2+-ATP enzyme.

Heart failure；Jiaweishenfu granule；Ultrastructure

R285.5

A

1004-745X（2014）04-0602-03

10.3969/j.issn.1004-745X.2014.04.016

广东省科技计划课题（2010B030700021）

2013-12-19）