三维适形调强放疗治疗新疆骨棘球蚴病大鼠后T淋巴细胞亚群的变化及意义

姚瑞祥，徐万龙

(1.乌鲁木齐市第一人民医院外二科，新疆 乌鲁木齐 830000；2新疆维吾尔自治区人民医院骨一科，新疆 乌鲁木齐 830000)

·论著·

三维适形调强放疗治疗新疆骨棘球蚴病大鼠后T淋巴细胞亚群的变化及意义

姚瑞祥1，徐万龙2

(1.乌鲁木齐市第一人民医院外二科，新疆 乌鲁木齐 830000；2新疆维吾尔自治区人民医院骨一科，新疆 乌鲁木齐 830000)

目的通过观察三维适形调强放疗(Intensity modulated radiation therapy，IMRT)对新疆大鼠继发性骨棘球蚴进行治疗后大鼠T淋巴细胞亚群的影响，探讨IMRT对骨包虫的杀灭机制是否与射线激发宿主对骨包虫有效的免疫反应有关。方法选取股骨继发性棘球蚴病大鼠50只，随机分为IMRT组及空白对照组各25只，以IMRT方式分别对IMRT组25只大鼠左侧股骨棘球蚴病区给予40 Gy剂量的放疗，于放疗1周后所有大鼠活杀取材，取脾制备细胞悬液,用流式细胞术(FCM)检测CD4+/CD8+的值。结果IMRT作用1周后，流式细胞仪检测结果提示，IMRT组大鼠脾淋巴细胞CD4+/CD8+的值(2.96±1.90)明显高于空白对照组(1.65±1.31)，差异具有统计学意义(t=0.544，P＜0.05)。结论IMRT可促进新疆大鼠继发性骨棘球蚴的凋亡，其作用机制可能是与射线激发宿主对骨包虫有效的免疫反应有关。

IMRT；骨；包虫；T淋巴细胞亚群

包虫病(Hydatid disease)是指由细粒棘球绦虫(Echinococcus granulosus，Eg)、多房棘球绦虫(E.oligarthrus)、寡节棘球绦虫(E.oligarthrus Diesing)和福氏棘球绦虫(E.vogeli Rausch＆Bernstein)的幼虫在人畜之间相互传染的寄生虫病，严重危害全球人类的健康。我国包虫病的发病率很高[1]，尤其是地处边疆的新疆[2]。骨包虫在人体各脏器包虫病的发病率位列第三，肝脏和肺脏的包虫病发病率则位居前两位。虽然骨包虫病在全世界有较高的发病率，但是临床上现有的药物以及手术的治疗方式对此病几乎不能根治，临床疗效较差，而放射治疗对骨包虫具有很好的杀灭作用。为了检测放射治疗除了对骨包虫除了直接杀灭作用外，是否还存在免疫杀灭作用，本研究通过对骨包虫病大鼠病灶区实施IMRT，并取大鼠脾制备细胞悬液，用流式细胞术(FCM)检测CD4+/CD8+的值，以期为临床上将IMRT用于对骨包虫的治疗，提供实验室证据。

1 材料与方法

1.1 实验动物的选取及分组选用新疆维吾尔自治区人民医院实验动物实验室提供的股骨继发性棘球蚴病成年雄性大鼠50只。随机分为IMRT组及空白对照组各25只，所有骨包虫大鼠均在CT、计算机辅助下精确勾画放射靶区和制定放疗计划后，以IMRT方式分别对IMRT组25只大鼠左侧股骨棘球蚴病区给予40 Gy剂量的放疗。

1.2 方法将经IMRT放射后的两组大鼠活杀处死，将大鼠左股骨骨髓腔内的骨包虫的包囊在显微镜下取出，经甲醛、戊二醛侵泡后低温保存。将标本经石蜡处理后切薄片，HE染色处理，在显微镜下观察。剩余部分标本经戊二醛、锇酸处理，脱水后切薄片，在电子显微镜下观察。通过光镜及电镜对接受放疗后骨棘球蚴包囊细胞形态学的观察以了解IMRT对骨包虫的杀灭效果。同时于显微镜下取脾脏，无菌盐水冲洗后碾碎，过筛后离心，溶解红细胞，离心后调整细胞浓度至1×107ml/L，加入抗体后流式细胞仪于488 nm波长下测定细胞绿色荧光，并检测T淋巴细胞亚群CD4+、CD8+细胞的比值，以观察放疗对大鼠主免疫功能所产生的影响。

1.3 统计学方法应用SPSS19.0统计软件进行数据分析。所测得的大鼠脾淋巴细胞CD4+/CD8+的值以均数±标准差±s)表示，两组之间比较采用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 IMRT对骨包虫的杀灭效果经放射后的骨包虫囊壁可见大量的变性坏死，生发细胞大量减少，细胞板层结构受损，出现层列，间隙间可见空泡样改变，甚至一些细胞直接出现崩裂样状态，无法分辨正常的细胞形态。电子显微镜下可见：所有正常细胞形态消失，细胞胞质排列疏散，线粒体变粗肿胀，线粒体内嵴拥挤、断开，内质网脱颗粒样改变，疏松，细胞核崩裂、固缩，可见凋亡小体，见图1。

图1 IMRT放疗后骨棘球蚴包囊细胞(电镜×8 000)

2.2 IMRT对大鼠主免疫功能所产生影响IMRT作用1周后流式细胞仪检测结果提示，IMRT组大鼠脾淋巴细胞CD4+/CD8+的值为(2.96±1.90)，较空白对照组大鼠脾淋巴细胞CD4+/CD8+的值(1.65±1.31)有明显升高，且差异具有统计学意义(t=0.544，P＜0.05)。

3 讨论

自1996年美国纽约的MemorialSloan-Kettering Cancer Center首先发表文章阐述适形调强放射治疗技术至今，IMRT已有15年的发展历史。IMRT是通过计算机来控制射线的方向，将精确的、剂量高的射线集中在我们所关心的病变组织区域，而周围组织很少受到射线的损伤，所以IMRT是现有临床上一种可靠的、精度高的放射治疗方法，受到学者的推崇。由于IMRT对肿瘤细胞有很高的杀灭作用，笔者认为IMRT对骨包虫的细胞也应该有很好的杀灭作用。本研究对骨包虫病实施IMRT，通过光镜、电镜对接受放疗后骨棘球蚴包囊细胞形态学的观察，可以看到IMRT射线集中，局部高能杀灭骨包虫，而且放射线可将深藏于松质骨、骨小梁中间的骨包虫头节清除彻底，降低骨包虫残留率、复发率。

本实验证明了IMRT对杀灭骨棘球蚴病具有很好的效果，放射线对骨包虫除了具有直接杀灭作用外，是否还存在免疫杀灭作用呢？部分学者认为IMRT应有一定的杀灭骨包虫的作用，且其机制可能与射线激发宿主对骨包虫有效的免疫反应有关[2-7]。

本研究通过流式细胞仪检测激活的CD4+/CD8+的T细胞比值变化，以此探讨IMRT对骨细粒棘球蚴感染大鼠所致宿主免疫功能变化的影响。T细胞的分类，按T细胞的分化群(Cluster of differentiation，CD)以及在机体内免疫应答所发挥的作用不一样，将其分为CD4+(TH/TDTH)以及CD8+(TS/TC)等不同的细胞亚群。CD4+T细胞具有辅助和诱导功能，CD8+T细胞具有抑制和细胞毒性功能，各功能亚群之间是相互联系、相互促进、相互制约的。CD4+/CD8+的比值可以间接提示集体的免疫水平、免疫功能的调节控制状态，如果比值降低则间接提示免疫状态的抑制，反之则意味着免疫状态的增强。

本研究通过对骨包虫病大鼠病灶区实施IMRT，并取脾制备细胞悬液，用流式细胞术(FCM)检测CD4+/CD8+的值，以期为探讨IMRT促进新疆大鼠继发性骨棘球蚴的凋亡机制是否与射线激发宿主对骨包虫有效的免疫反应有关。本研究结果提示IMRT作用1周后，流式细胞仪检测到IMRT组大鼠脾淋巴细胞CD4+/CD8+的值明显高于空白对照组，差异具有统计学意义。提示IMRT可通过刺激大鼠淋巴细胞亚群的CD4+细胞增多为主形成保护性免疫，从免疫机制方面限制了骨包虫在机体内进一步繁殖、扩增的可能，可以增加宿主防御、控制骨包虫的增长。本实验初步证实IMRT对新疆大鼠继发性骨棘球蚴病的杀灭机制可能是与射线激发宿主对骨包虫有效的免疫反应有关，但具体的通路及信号转导过程需要进一步探索。

[1]史大中.中国囊性包虫病的地理分布[J].地方病通报,2000,15 (1):74-75.

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Significance of T lymphocyte subsets in rats with echinococcosis in Xinjiang after intensity modulated radiation therapy.

YAO Rui-xiang1,XU Wan-long2.
1.The Second Department of Surgery,the First People's Hospital of Urumqi,

Urumqi 830011,Xinjiang,CHINA;2.The First Department of Orthopedic,People's Hospital of Xinjiang Uygur Autonomous Region,Urumqi 830011,Xinjiang,CHINA

ObjectiveTo observe the change and significance of T lymphocyte subsets in rats of Xinjiang with echinococcosis after intensity modulated radiation therapy(IMRT),and explore the possible mechanism.MethodsFifty cases of rats with secondary echinococcosis at femurs were selected and randomized into two groups equally.25 rats in IMRT group were given IMRT at the left femur,where the echinococcosis located，with a total irradiation doses of 40 Gy.And one week after radiation,the spleen cells were collected from all rats.The value of CD4+/ CD8+was detected by flow cytometry.ResultsOne week after IMRT,the value of CD4+/CD8+in the IMPT group (2.96±1.90)was significantly higher than that in the blank control group(1.65±1.31).ConclusionIMRT contributes to the therapy of secondary echinococcosis，with a underlying mechanism of activation in effective parasite-host immune response which is initiated by radiation.

Intensity modulated radiation therapy;Bone;Echinococcosis;T lymphocyte subsets

R-332

A

1003—6350（2014）17—2497—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2014.17.0979

2014-03-24)

国家自然科学基金项目（编号：81360276)；新疆维吾尔自治区青年科技创新人才培养工程项目-青年博士科技人才培养项目（编号：2013731013)；新疆维吾尔自治区科技支疆项目（编号：201391129)；新疆维吾尔自治区自然科学基金项目（编号：2012211B34)

徐万龙。E-mail：xuwanlong20082008@163.com