BriCyte E6和FACSCantoⅡ流式细胞仪在淋巴细胞亚群分析中的对比研究

孙庆国，赵文静，匡玉吉，李 炜，周翠红，董丽芳，张宝华

（吉林省肝胆病医院，吉林长春130062）

BriCyte E6和FACSCantoⅡ流式细胞仪在淋巴细胞亚群分析中的对比研究

孙庆国＊，赵文静＊，匡玉吉，李 炜，周翠红，董丽芳，张宝华

（吉林省肝胆病医院，吉林长春130062）

流式细胞术是在上个世纪70年代逐渐发展起来的一种集光学、电子、流体力学、计算机、生物学等多个学科，能够对细胞的物理和化学特性进行检测和分析的一种技术。最初，流式细胞仪的应用范围主要限于细胞生物学、免疫学、遗传学、植物学等基础研究领域。不过随着基础研究成果不断向临床应用转化，流式细胞仪也开始从研究领域扩展到临床领域。

临床上，流式细胞仪主要应用于淋巴细胞亚群分析。淋巴细胞大致分为T淋巴细胞（CD3＋细胞）、B淋巴细胞（CD3－CD19＋细胞）和NK细胞（CD3－CD16／56＋细胞）3个亚群。此外根据是否表达CD4和CD8，还可以将T淋巴细胞进一步划分为辅助／诱导T淋巴细胞（CD3＋CD4＋细胞）和抑制／细胞毒T淋巴细胞（CD3＋CD8＋细胞）。淋巴细胞的分类计数对于免疫缺陷病、肿瘤、感染性疾病、自身免疫病等疾病的诊断、治疗监控、预后判断都具有重要意义。

本研究的主要目的是对BriCyte E6和FACSCantoⅡ流式细胞仪在淋巴细胞亚群检测中的一致性进行评价。

1 资料与方法

1.1 临床资料

1.1.1 研究对象 选择免疫缺陷病、自身免疫病、肿瘤、感染性疾病、器官移植、过敏性疾病等患者及健康体检者共117例，获取新鲜抗凝静脉血样本。其中男性37例，女性80例，年龄8－84岁，平均年龄50.58±19.39。

1.1.2 材料和方法 按试剂说明书，分别使用深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司（迈瑞）的PerCP－CD45／FITC－CD3／APC－CD4／PE－CD8四色试剂（流式细胞法）、PerCP－CD45／FITC－CD3／APCCD19／PE－CD16＋56四色试剂（流式细胞法）以及BD公司的淋巴细胞亚群检测试剂盒对外周静脉血样本进行处理。处理后的样本在BriCyte E6和FACSCantoⅡ上分别使用客户端软件MRFlow和FACSCantoII Clinical Software进行检测，获得CD3＋细胞、CD3＋CD4＋细胞、CD3＋CD8＋细胞、CD3－CD19＋细胞以及CD3－CD16／56＋细胞的百分比和绝对计数。

1.1.3 统计学分析 对两台仪器的结果进行相关分析、线性回归分析和Bland－Altman分析，计算相关系数R、回归方程和偏差。统计分析采用SAS 9.0。

2 结果

2.1 BriCyte E6和FACSCantoⅡ流式细胞仪检测淋巴细胞亚群的结果图

MRFlow和FACSCanto Clinical Software均能实现淋巴细胞亚群自动检测、分析和报告。由于BriCyte E6可以直接测量样本体积，因此无需在样本中额外添加参比的荧光微球，即可获得样本中细胞的绝对计数结果（图1）。相反，FACSCantoⅡ由于不能测量样本体积，因此在测定时需要在样本中添加一定量的荧光微球，然后通过间接计算才能得出绝对计数结果（图2）。

图1 BriCyte E6流式细胞仪检测淋巴细胞亚群结果图

图2 FACSCantoⅡ流式细胞仪检测淋巴细胞亚群结果图

2.2 淋巴细胞亚群的百分比

以两仪器百分比测定结果做线性回归显示，两仪器结果间线性方程的斜率在0.9534－1.0247间，截距在－0.2642～0.6914间，判定系数（R2）均大于0.96（图3）。以两仪器测定结果均值（Average）和差值（Bias）做Bland－Altman分析显示，仪器测定结果间的差值均值在－1.3692～1.1488，95%一致性界限也在较窄的范围内（图4）。

图3 淋巴细胞亚群百分比（%）的线性回归图

图4 两种仪器淋巴细胞亚群百分比（%）的Bland－Altman图

2.3 淋巴细胞亚群绝对计数

以两仪器绝对计数测定结果做线性回归分析显示，两仪器结果间线性方程的斜率在0.9348－0.9856间，截距在－10.9201～15.9736间，判定系数（R2）均大于0.96（图5）。以两仪器测定结果均值（Average）和差值（Bias）做Bland－Altman分析显示，仪器测定结果间的差值均值在－41.6958～－8.5849，95%一致性界限也在较窄的范围内（图6）。

图5 淋巴细胞亚群绝对计数（＃）的线性回归图

图6 两种仪器淋巴细胞亚群绝对计数（＃）的Bland－Altman图

3 讨论

不同的流式细胞仪在使用不同的试剂进行淋巴细胞亚群分析时，可能会存在较大的偏差，因此临床上建议实验室使用同厂配套的试剂系统进行样本处理［1］。为了减少不同试剂系统对于检测的影响，本研究在对BriCyte E6和FACSCanto II的一致性评价中也采用了仪器生产商推荐的同厂试剂。从结果可以看出，两种仪器的淋巴细胞亚群检测结果间具有较好的线性关系，且结果间的差值也较小，说明两种仪器在淋巴细胞亚群分析上具有良好的一致性。

在流式细胞仪上进行细胞绝对计数可以分为双平台法和单平台法。双平台法从流式细胞仪上获得淋巴细胞亚群的百分比，同时从血细胞分析仪获得淋巴细胞的绝对值，并通过细胞绝对值与百分比的乘积得出各类淋巴细胞亚型的绝对计数。单平台法则不用借助血细胞分析仪的结果，仅从流式细胞仪单一平台上就可以获得细胞绝对计数。单平台法也包括两种绝对计数测量方式：一种是流式细胞仪通过直接测量样本体积，然后以测量细胞数除以样本体积就可直接获得细胞的绝对计数（如迈瑞、Partec和Merck Millipore的产品）；另一种方式则需要在样本中添加一定数量的绝对计数参比微球，然后通过复杂计算来间接获得细胞的绝对计数（如BD和Beckman Coulter的产品）。有研究者曾对这两种方式的CD3＋CD4＋细胞绝对计数做过比较，结果表明两种方式的测定值呈现良好的相关性，测定值间的偏差也较小［2－5］。本研究也显示，基于体积和基于参比微球的两种单平台测量方式，不仅在CD3＋CD4＋细胞检测上具有较高的相关系数和较低的偏差，而且在其他淋巴细胞亚群的检测上也体现了良好的一致性。此外，相对于使用参比微球，直接测量体积的单平台方法测试成本更低，操作也更为简单，对于改善国内基层医院以及国际上经济发展落后国家和地区的诊疗水平也具有重要意义。

［1］黄春梅，郭 野，陈 倩，等.不同流式细胞分析系统对外周血淋巴细胞亚群分析结果的影响［J］.中华检验医学杂志，2011，34（5）：403.

［2］Dieye TN，Vereecken C，Diallo AA，et al.Absolute CD4T－cell counting in resource－poor settings：direct volumetric measurements versus bead－based clinical flow cytometry instruments［J］.J Acquir Immune Defic Syndr，2005，39（1）：32.

［3］Pattanapanyasat K，Phuang－Ngern Y，Lerdwana S，et al.Evaluation of a single－platform microcapillary flow cytometer for enumeration of absolute CD4＋T－lymphocyte counts in HIV－1infected Thai patients［J］.Cytometry B Clin Cytom，2007，72（5）：387.

［4］Pattanapanyasat K，Phuang－Ngern Y，Sukapirom K，et al.Comparison of 5flow cytometric immunophenotyping systems for absolute CD4＋T－lymphocyte counts in HIV－1－infected patients living in resource－limited settings［J］.J Acquir Immune Defic Syndr，2008，49（4）：339.

［5］Zijenah LS，Kadzirange G，Madzime S，et al.Affordable flow cytometry for enumeration of absolute CD4＋T－lymphocytes to identify subtype C HIV－1infected adults requiring antiretroviral therapy（ART）and monitoring response to ART in a resourcelimited setting［J］.J Transl Med，2006，45：433.

2013－06－27）

1007－4287（2014）07－1196－04

＊通讯作者