STZ 性糖尿病性大鼠白内障的AQP0、AQP1下调表达及Ca2+内流参与机制

沈烨宇，刘文斌

(南京明基医院眼科，江苏南京 210019)

·论著·

STZ 性糖尿病性大鼠白内障的AQP0、AQP1下调表达及Ca2+内流参与机制

沈烨宇，刘文斌

(南京明基医院眼科，江苏南京 210019)

目的分析钙内流及水通道蛋白AQP0/1在链脲佐菌素(STZ)诱导的糖尿病大鼠白内障发病中的参与机制，为相关研究与临床治疗提供参考。方法40只糖尿病大鼠随机分为糖尿病模型组(n=20)和药物干预组(钙通道阻滞剂硝苯地平组，n=20)，20只同批次相同饲养条件的大鼠作为正常对照组。药物干预组大鼠第5周到8周持续给予钙通道阻滞剂硝苯地平灌胃治疗(60 mg/kg)，共持续4周。Western blot分析各组中AQP0/1及炎症因子IL-6的表达。结果与对照组比较，糖尿病模型组大鼠晶状体中AQP0/1表达下调(P＜0.01)，IL-6表达上调(P＜0.01)；与糖尿病模型组比较，钙通道阻滞剂可以部分恢复AQP0/1的异常作用(P＜0.05)，对IL-6也有一定的改善作用(P＜0.05)。结论高血糖诱发炎症因子IL-6上调表达，并进一步增强细胞钙内流及AQP0/1下调表达。

糖尿病；白内障；AQP；钙内流；IL-6

随着人口老龄化、生活方式的改变以及诊疗技术的提高，糖尿病患病人数迅速增加[1-2]。糖尿病已成为严重威胁人类健康的世界性公共卫生问题。世界范围内糖尿病发病率高达2%，成为除肿瘤、冠心病、脑血管病以外的第四大威胁人类健康的疾病。糖尿病性白内障是其重要的并发症之一，是临床上严重的致盲性眼病之一。水通道蛋白在机体各个组织中均有广泛的表达，其对水分的有效运转对维持眼睛的正常功能具有重要的作用[3-5]。

本文通过腹腔注射复制糖尿病大鼠白内障模型，探讨水通道蛋白、钙内流及炎症因子IL-6在其发生发展中的作用，为相关的研究和临床治疗提供参考。

1 材料与方法

1.1 动物、药品及试剂 SD大鼠，雌雄不拘，由浙江省实验动物中心提供；链脲佐菌素(Streptozotocin，STZ)购自美国Sigma公司；兔抗鼠AQP0/1抗体、兔抗IL-6抗体(美国Santa Cruz公司)、HRP标记的二抗及DAB显色液购自武汉博士德生物工程有限公司。

1.2 仪器 低温高速离心机由德国Eppendorf生产；PCR仪及凝胶成像仪购自Bio-RAD公司；CO2培养箱购自上海新苗仪器厂；蛋白质电泳仪(DYY-7C)购自北京市六一仪器厂。

1.3 动物模型复制 采用STZ(60 mg/kg)腹腔注射复制大鼠糖尿病模型，选择持续8周血糖水平超过16.7 mmol/L者作为糖尿病大鼠。40只糖尿病大鼠随机分为糖尿病模型组(n=20)和药物干预组(钙通道阻滞剂硝苯地平组，n=20)，20只同批次相同饲养条件的大鼠作为正常对照组。药物干预组大鼠第5周到8周持续给予钙通道阻滞剂硝苯地平灌胃治疗(60 mg/kg)，共持续4周。每只大鼠自由饮水，每天给予15 g标准大鼠饲料。STZ注射8周后处理动物，血样被收集离心(4 000 g，15 min，4°C)，分离血清进行生化分析。

1.4 Western blot 三组大鼠在处死之后立即于冰面上取0.1 g晶状体组织，加入0.5 ml裂解液，冰浴中充分匀浆。匀浆液13 000 g，4°C离心20 min，吸取上清以考马斯亮蓝测定蛋白含量后，计算含50 μg蛋白的加样体积。将蛋白样品与1/4体积的5×SDS加样缓冲液混合，沸水煮沸5 min变性。经SDS-PAGE电泳后，将蛋白电转至硝酸纤维素膜上，封闭液室温封闭1 h，然后按照顺序依次加入一抗和二抗进行孵育。PBST洗3次，每次15 min,DAB显色，UVP影像分析系统照相，以β-actin作为蛋白表达内参照。

1.5 观察指标 观察正常对照组、糖尿病模型组及药物干预组大鼠的一般状态(包括饮水、尿量、体重、毛色以及晶状体状态)、血清血糖及胆固醇水平的变化以及晶状体中AQP0/1蛋白和IL6蛋白的表达变化。

1.6 统计学方法 数据统计采用SPSS17.0统计软件完成。所有数据均用均数±标准差()表示，多组间比较采用单因素ANOVA分析，以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 动物一般状态观察注射STZ后，成模动物饮水、尿量明显增加，体重减轻，皮毛光泽差。同时，采用裂隙灯观察发现，模型组大鼠晶状体周边可见到空泡，且有絮状混浊。解剖前模型组大鼠晶状体完全混浊，钙通道阻滞剂西苯地平干预组大鼠晶状体混浊程度较模型组轻。而对照组大鼠的晶状体全部透明。

2.2 糖尿病大鼠血糖及总胆固醇水平变化 糖尿病模型组和药物干预组大鼠血糖水平分别为(28.5±2.54)mmol/L和(26.3±3.10)mmol/L。与对照组比较，糖尿病组和药物干预组大鼠血糖水平明显升高，且差异具有显著统计学意义(P＜0.01)，但两组之间相比差异则无统计学意义(P＞0.05)；同时，与对照组相比，糖尿病组大鼠总胆固醇水平也明显升高(P＜0.01，P＜0.05)，但与药物干预组比较，差异无统计学意义(P＞0.05)，见表1。

表1 糖尿病大鼠血糖及总胆固醇水平变化()

表1 糖尿病大鼠血糖及总胆固醇水平变化()

2.3 药物干预组上调被抑制的AQP0/1表达 糖尿病模型组大鼠AQP0/1的蛋白质表达较对照组均明显下调，且其差异具有统计学意义，钙通道阻滞剂硝苯地平可部分恢复异常表达的AQP0/1，见图1。

2.4 药物干预上调被抑制的炎症因子IL-6的表达 糖尿病模型组组大鼠IL-6的蛋白质表达较对照组均明显上调(P＜0.01)，且差异具有统计学意义，钙通道阻滞剂硝苯地平对异常表达的IL-6有明显的改善作用(P＜0.05)，见图2。

图1 钙通道阻滞剂NIF上调被抑制的AQP0/1表达

图2 钙通道阻滞剂NIF上调被抑制的炎症因子IL-6表达

3 讨论

糖尿病与肿瘤、高血压等是严重影响人类健康的疾病。糖尿病的发病率和死亡率有逐年升高的趋势，其微血管病变和大血管病变导致的并发症是目前其致死、致残的重要原因。研究证实，糖尿病及其并发症的主要发病分子机制包括[6-9]：长期持续的高血糖可引起诸如蛋白质，脂类等生物大分子糖基化，产生大量晚期糖基化终末产物(Advanced glycation end products，AGEs)，造成AGEs在体内聚集，最终使蛋白发生交联，导致血管刚性增强和通透性增高；体内细胞因子异常表达，导致机体炎症反应并诱发糖尿病并发症；AGEs还可以介导还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH)氧化酶(NOX)的激活，导致细胞内NAD(P)H的水平下降，从而抑制内皮型一氧化氮合酶(Endothelial nitric oxide synthase，eNOS)活性，减少舒血管物质NO的生成。其中糖尿病视网膜病变是其主要的微血管并发症之一，但是目前对其确切的发病机制尚不明确。本文采用一次性大剂量腹腔注射STZ复制糖尿病大鼠视网膜病变模型，分析了钙内流及水通道蛋白AQP0/1在STZ诱导的糖尿病大鼠白内障发病中的参与机制，为相关研究与临床治疗提供参考。

IL-6是机体免疫反应的重要因子，其可以延长中性粒细胞的凋亡过程，促进中性粒细胞氧化反应。魏巍等[10]探讨2型糖尿病合并缺血性脑卒中患者血清核因子(NF-κB)、白细胞介素-6(IL-6)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的变化，结果发现血清NF-κB、IL-6、TNF-α表达水平与疾病发生、发展和转归密切相关；血管损伤、炎症因子释放可能在患者的发病过程中具有重要作用。赵军等[11]检测2型糖尿病患者眼房水中血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)、白细胞介素-6(Interleukin-6，IL-6)和瘦素(Leptin)的含量，结果发现VEGF、IL-6、瘦素在糖尿病性视网膜病变的形成过程中有重要作用，且VEGF与IL-6、VEGF与瘦素之间有相关性。本文中也发现，糖尿病组大鼠晶状体IL-6蛋白质表达较对照组大鼠均明显下调(P＜0.01)，且差异具有统计学意义，而钙通道阻滞剂硝苯地平对恢复异常表达的IL-6有明显作用(P＞0.05)，提示IL-6参与了糖尿病大鼠白内障的发病过程，且钙离子内流可能是由IL-6所调节。

水通道蛋白(AQP)是体内一类介导水沿着渗透压梯度被动运输的蛋白质，其参与晶状体的水分代谢对晶状体生理动态平衡和晶状体的透明性具有决定性的作用[12-13]。本文发现，糖尿病模型组大鼠晶状体AQP0/1的表达较对照组均明显下调，且与正常对照组相比具有显著的统计学意义(P＜0.01)。同时我们在观察大鼠晶状体时也发现，对照组大鼠晶状体透明而模型组晶状体严重出现浑浊，这与AQP的表达具有一致性。因此，大鼠晶状体的AQP0/1蛋白对大鼠晶状体功能的正常维系具有重要的作用，即水分的正常代谢在晶状体发挥正常生理功能的组成部分。同时，钙离子通道阻滞剂硝苯地平药物干预可以部分恢复糖尿病模型组大鼠晶状体AQP的异常表达，提示钙离子内流可能部分影响AQP蛋白的表达。

因此，糖尿病白内障与晶状体内水通道蛋白和IL-6的异常表达有关，其机制可能是高血糖诱发炎症因子IL-6上调表达，并进一步增强细胞钙内流及AQP0/1下调表达。

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Depressed expression of AQP0/1 and Ca2+influx involved in STZ-induced diabetic cataract.

SHEN Ye-yu,LIU Wen-bin.
Department of Ophthalmology,Nanjing Benq Hospital,Nanjing 210019,Jiangsu,CHINA

ObjectiveTo explore the involvement of AQP0/1 and Ca2+influx in streptozotoxin(STZ)-induced diabetic cataract.MethodsForty male SD rats were divided into diabetic model group(n=20)and calcium channel blocker(nifedipine)group(n=20),while 20 normal rats were taken as control group.The diabetic model group was replicated by injection of streptozotoxin(STZ),and calcium channel blocker group was given 60 mg/kg nifedipine from the fifth week to the eighth week.The concentration of serum blood glucose and cholesterol was analyzed.The expression of AQP0/1 and IL-6 were detected by Western blot.ResultsCompared with the control group,the expression of AQP0/1 were down-regulated and the expression of IL-6 was up-regulated in diabetic model group(P＜0.01).Compared with diabetic model group,the abnormal expression of AQP0/1 and IL-6 was significantly alleviated in calcium channel blocker group(P＜0.05).ConclusionHigh concentration of glycemia upregulated the expression of IL-6 which enhanced the downregulated expression ofAQP0/1.

Diabetes;Cataract;AQP;Calcium influx;IL-6

R-332

A

1003—6350（2014）22—3290—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2014.22.1291

2014-04-10)

刘文斌。E-mail：sunnyrain_98@126.com