靶向Pim蛋白激酶抗肿瘤药物的研究进展及设想

刘浩秋

1.四川大学生命科学学院生物技术系，成都 610065；2.四川大学华西医院生物治疗国家重点实验室，成都 610065

靶向Pim蛋白激酶抗肿瘤药物的研究进展及设想

刘浩秋1，2

1.四川大学生命科学学院生物技术系，成都 610065；2.四川大学华西医院生物治疗国家重点实验室，成都 610065

Pim原癌基因编码的丝/苏氨酸蛋白激酶在恶性血液病和实体瘤的发生发展过程中普遍过度表达，并被证明在细胞的增殖、分化、新陈代谢中起到重要调控作用。为了弄清Pim蛋白激酶的特性，以指导合成高成药性小分析靶向抑制剂，文章回顾了近年来国外在Pim蛋白激酶领域最新研究成果，着重分析了Pim激酶在分子层面上的功能和作用机制，以及Pim蛋白激酶抑制剂开发的前提条件，包括已获得的Pim蛋白三维晶体结构和Pim基因完整序列，提出了通过基于生物信息学、药理学的靶向小分子药物的设计、合成和筛选，人工合成Pim蛋白激酶抑制剂，研发新型抗肿瘤药物的思路。

Pim；小分子药物设计；蛋白激酶抑制剂

在不到20年的时间内，我国恶性肿瘤在死亡原因中所占的比例已经从12.6%上升至17.9%，每年新增患者数达170万，另有130余万人死于癌症[1]。肿瘤化疗技术的强毒副作用、耐药性等问题目前依然是临床肿瘤药物治疗中的主要难题。

阐明肿瘤疾病的分子机制，理解肿瘤细胞的信号转导网络，有益于设计靶向性优良的抗肿瘤药物。近几年来，随着生命科学研究的迅猛发展，基于肿瘤特异性分子设计的靶向抗肿瘤小分子合成药物越来越受到科学界的关注，其中以蛋白激酶为目的靶点的抗肿瘤小分子合成已成为全球的研究热点[2]。

1 Pim蛋白激酶研究进展

Pim激酶是一种丝/苏氨酸蛋白激酶，属于与钙/钙调蛋白调节激酶相关的蛋白激酶家族，已发现Pim-1、Pim-2 和Pim-3三个成员。在ATP结合区域，Pim激酶家族的三个成员有60～70%的序列是一致的，它们都是原癌基因pim编码。

Pim最早是在莫洛尼小鼠白血病病毒（MoMuLV）实验过程中被发现[3]，其后被证实与细胞增殖、分化、凋亡以及肿瘤发生联系紧密（图1）。Aho等[4]研究发现Pim-1激酶可磷酸化凋亡蛋白Bad的第112个丝氨酸，使其丧失活性，进而保护细胞不受Bad凋亡效应的影响。

Pim-1不仅有抑制凋亡的功能，研究还发现Pim-1激酶能够加速细胞周期的进程。Pim-2蛋白由于与Pim-1具有高度的同源性而具有相似功能。Bin等[5]研究发现，Pim-2的加强表达虽不能直接调控Bcl-2、Bcl-xl、Bad蛋白的表达，但也能使凋亡蛋白Bad第l12个丝氨酸磷酸化，阻碍Bad-Bcl-Xl的信号转导，从而逆转Bad诱导的细胞凋亡。Pim家族的新成员Pim-3研究成果相对较少，但其在功能上也与Pim-1、Pim-2相似，可以磷酸化非常多的特异性底物，在细胞周期和细胞凋亡进程中具有重要调控作用[6]，可以阻碍胰腺瘤细胞的凋亡，促进胰腺肿瘤的形成[7]。

Pim-1、Pim-2和Pim-3已经被发现在很多实体瘤和恶性血液病中过度表达。Xu等[8]研究发现，Pim-1可作为一种新的生物标记预测前列腺癌的进程；Dai等[9]研究发现，前列腺癌细胞核和细胞质中Pim-2过度表达，此外Pim-1、Pim-2激酶与酪氨酸激酶抑制剂的耐药性有关；Deneen[10]和Fuji[11]分别报道了Pim-3在人类肝癌细胞和肝癌细胞组织中过度表达，它可以促使Ewing家族肿瘤细胞的生长；Li等[7]发现Pim-3能够在人类胰腺癌和结肠癌中过度表达；Zheng 等[12]通过检测发现，Pim-3表达可用于预测胃癌患者的预后。

上述研究显示，Pim激酶可能成为相关抗肿瘤药物的重要靶标，Pim激酶小分子抑制剂在癌症治疗方面具有一定价值。

图1 Pim蛋白激酶功能

2 Pim蛋白激酶抑制剂研究进展

目前，只有少数选择性Pim激酶抑制剂被报道，其主要以Pim-1和Pim-2为靶标。这些Pim激酶抑制剂具有截然不同的化学结构，且酶抑制活性一般在两位数的纳摩级水平，如十字孢碱有机铷络合物[13-14]、取代吡啶酮类化合物[15]、黄酮类化合物[7，16]和喹啉二酮类化合物[17]。虽然前人已经在该领域进行了一系列的研究，但发展一类具有新结构的选择性Pim激酶抑制剂同时针对Pim-1、Pim-2和Pim-3靶标仍然是一项具有挑战性的工作，而且越来越受到人们的关注，也正是由于Pim激酶作为关键的调节因素在肿瘤形成的各个方面都发挥重要作用，所以提高Pim激酶抑制剂的选择性不仅仅是基础研究的需要，更是发展新的抗肿瘤试剂的需要。在美国已有数家公司和研究所进行Pim抑制剂的研究，其中有的已经进入临床试验阶段，如咪唑并哒嗪类衍生物SGI-1776（SuperGen）[18]，即是Pim激酶的强抑制剂，正在研究用于治疗激素难治性和多西紫杉醇难治性前列腺癌。

Pim-1的基因序列已经测定，其蛋白分子结构也已经发表（PDB蛋白数据库中编号：1XWS）。对Pim激酶晶体结构中的结合位点以及其与底物的相互作用进行细致分析，弄清结合位点的相关属性，明确关键结合残基以及可能的结合区域，将促进开展基于结构的小分子药物设计或者结构改造的研究。一些课题组已经通过Pim-1的晶体结构设计了具有全新结构的选择性Pim激酶抑制剂[13-14，19-20]。Pim激酶具有唯一独特的结构（图2），在Pim激酶铰链区域有一个新构架，其中包含一个ATP结合位点和一个额外的氨基酸残基，这些在其他蛋白激酶结构中未被发现，这个残基是脯氨酸-123，由于缺乏氢键供体，它不能够与ATP形成氢键。Pim激酶结构的这个特征决定了其与Pim激酶抑制剂的结合模式[20]。

图2 Pim-1蛋白激酶晶体结构

3 进一步研究的设计

当前抗肿瘤药物的较强毒副作用以及耐药性问题很难满足临床肿瘤治疗的要求。肿瘤疾病的分子机制和细胞信号转导网络领域的最新成果显示，Pim蛋白激酶与细胞增殖[21]、分化、凋亡、肿瘤发生之间关系紧密[22]，并在很多实体瘤和恶性血液病[23-24]中过度表达，因此，可以基于Pim蛋白激酶晶体结构通过计算机辅助药物设计小分子抑制剂，用于抗肿瘤活性的筛选[25-26]。以蛋白激酶为目标靶点的抗肿瘤药物合成已经成为国际热点，但目前国内还没有任何一家制药公司或科研院所发表关于Pim激酶抑制剂用于癌症治疗的报道。

本研究基于文献整合与理论分析，结合前期科研工作基础及四川大学华西医院生物治疗国家重点实验室硬件条件，对靶点Pim蛋白激酶进行合理靶向小分子药物设计，结合Pim-1蛋白晶体结构的对接研究，在药效团模型和传统药物化学设计思路指导下，优选化合物并进行化学结构优化，构建新一类小分子化合物，有效靶向抑制Pim蛋白激酶，从而达到抑制肿瘤细胞增殖的作用。通过对候选化合物库进行生物信息学和化学信息学的虚拟筛选，系统地对体外酶水平和细胞水平进行实验，用统计学工具系统回归分析所得数据，进一步研究构效关系，提炼3D药效团，最终筛选出1～2个成药性高的化合物，期望通过已有的蛋白质晶体结构设计出有活性的抗肿瘤化合物。

[1]Steinmetz KA，Potter JD.Vegetables，fruit，and cancer.I.Epidemiology[J]. Cancer Causes Control，1991，2（5）：325-357.

[2]Cohen P.Protein kinases─the major drug targets of the twenty-first century?[J].Nat Rev Drug Discov，2002，1（4）：309-315.

[3]Theo Cuypers H，Selten G，Quint W，et al.Murine leukemia virus-induced T-cell lymphomagenesis：integration of proviruses in a distinct chromosomal region[J].Cell，1984，37（1-3）：141-150.

[4]Aho TL，Sandholm J，Peltola KJ，et al.Pim-1 kinase promotes inactivation of the pro-apoptotic bad protein by phosphorylating it on the Ser112 gatekeeper site[J].FEBS Lett，2004，571（1）：43-49.

[5]Yan B，Zemskova M，Holder S，et al.The PIM-2 kinase phosphorylates BAD on serine 112 and reverses BAD-induced cell death[J].J Biol Chem，2003，278（46）：45358-45367.

[6]Bachmann M，Möröy T.The serine/threonine kinase Pim-1[J].Int J Biochem Cell Biol，2005，37（4）：726-730.

[7]Li YY，Popivanova BK，Nagai Y，et al.Pim-3，a proto-oncogene with serine/threonine kinase activity，is aberrantly expressed in human pancreatic cancer and phosphorylates bad to block bad-mediated apoptosis in human pancreatic cancer cell lines[J].Cancer Res，2006，66（13）：6741-6747.

[8]Xu Y，Zhang T，Tang H，et al.Overexpression of PIM-1 is a potential biomarker in prostate carcinoma[J].J Surg Oncol，2005，92（4）：326-330.

[9]Dai H，Li R，Wheeler T，et al.Pim-2 upregulation：biological implications associated with disease progression and perinueral invasion in prostate cancer[J].Prostate，2005，65（3）：276-286.

[10]Deneen B，Welford SM，Ho T，et al.Pim-3 proto-oncogene kinase is a common transcriptional target of divergent EWS/ETS oncoproteins[J]. Mol Cell Biol，2003，23（11）：3897-3908.

[11]Fujii C，Nakamoto Y，Lu P，et al.Aberrant expression of serine/threonine kinase Pim-3 in hepatocellular carcinoma development and its role in the proliferation of human hepatoma cell lines[J].Int J Cancer，2005，114（2）：209-218.

[12]Zheng HC，Tsuneyama K，Takahashi H，et al.Aberrant Pim-3 expression is involved in gastric adenoma-adenocarcinoma sequence and cancer progression[J].J Cancer Res Clin Oncol，2008，134（4）：481-488.

[13]Bregman H，Meggers E.Ruthenium half-sandwich complexes as protein kinase inhibitors：an N-succinimidyl ester for rapid derivatizations of the cyclopentadienyl moiety[J].Org Lett，2006，8（24）：5465-5468.

[14]Debreczeni JE，Bullock AN，Atilla GE，et al.Ruthenium half-sand wich complexes bound to protein kinase Pim-1[J].Angew Chem Int Ed Enql，2006，45（10）：1580-1585.

[15]Cheney IW，Yan S，Appleby T，et al.Identification and structure-activity relationships of substituted pyridones as inhibitors of Pim-1 kinase[J].Bioorg Med Chem Lett，2007，17（6）：1679-1683.

[16]Holder S，Lilly M，Brown ML.Comparative molecular field analysis of flavonoid inhibitors of the Pim-1 kinase[J].Bioorg Med Chem，2007，15（19）：6463-6473.

[17]Tong Y，Stewart KD，Thomas S，et al.Isoxazolo[3，4-b]quinoline-3，4 （1H，9H）-diones as unique，potent and selective inhibitors for Pim-1 and Pim-2 kinases：Chemistry，biological activities，and molecular modeling[J].Bioorg Med Chem Lett，2008，18（19）：5206-5208.

[18]Arunesh GM，Shanthi E，Krishna MH，et al.Small molecule inhibitor of Pim-1 kinase:July 2009 to February 2013 patent update.[J].Expert Opin Ther Pat，2014，24（1）：5-17.

[19]Pogacic V，Bullock AN，Fedorov O，et al.Structural analysis identifies imidazo[1，2-b]pyridazines as Pim kinase inhibitors with in vitro antileukemic activity[J].Cancer Res，2007，67（14）：6916-6924.

[20]Jacobs MD，Black J，Futer O，et al.Pim-1 ligand-bound structures reveal the mechanism of serine/threonine kinase inhibition by LY294002[J].J Biol Chem，2005，280（14）：13728-13734.

[21]Beharry Z，Mahajan S，Zemskova M，et al.The Pim protein kinases regulate energy metabolism and cell growth[J].Proc Nati Acad Sci U S A，2011，108（2）：528-533.

[22]Narlik-Grassow M，Blanco-Aparicio C，Cecilia Y，et al.Conditional transgenic expression of Pim1 kinase in prostate Induces inflammation-dependent neoplasia[J].PLoS One，2013，8（4）：e60277.

[23]Aguirre E，Renner O，Narlik-Grassow M，et al.Genetic modeling of Pim proteins in cancer：proviral tagging and cooperation with onco genes，tumor suppressor genes，and carcinogens[J].Front Oncol，2014，（4）109.

[24]Liang C，Li YY.Use of regulators and inhibitors of Pim-1，a serine/ threonine kinase，for tumour therapy（Review）[J].Mol Med Rep，2014，9（6）：2051-2060.

[25]Ogawa N，Yuki H，Tanaka A.Insights from Pim1 structure for anticancer drug design[J].Expert Opin Drug Discov，2012，7（12）：1177-1192.

[26]Swords R，Kelly K，Carew J，et al.The Pim kinases：new targets for drug development[J].Curr Drug Targets，2011，12（14）：2059-2066.

The research progress and design of the anticancer drugs targeting the Pim protein kinases

LIU Hao-qiu1,2
1.Department of Biotechnology,College of Life Science of Sichuan University,Chengdu 610065,China;2.National Key Laboratory of Biological Treatment of West China Hospital in Sichuan University,Chengdu 610065,China

The serine/theronine protein kinases encoded by proto-oncogene Pim are overexpressed in the genesis of a range of hematological malignancies and solid cancers,and were proved to have played a significant regulatory role in the cell proliferation,differentiation and metabolism.In order to clarify the characters of Pim protein kinases to guide the synthesis of the anti-tumor molecular drugs with potentdruggability,this review summarized the latest research results in recent years abroad in this field and analyzed the functions and biochemical mechanism of Pim protein kinases in the molecular level.Furthermore,this review focused on the prerequisite of the development of Pim protein kinase inhibitors,especially the three-dimensional crystal structures and complete Pim gene sequences,proposing a promising molecular drug design for the synthesis of Pim protein kinase inhibitors through the pharmacological method of targeting,synthesis and screening.

Pim;Micro-molecular drug design;Protein kinase inhibitors

R979.1

A

1674-4721（2014）010（a）-0191-03

2014-08-22本文编辑：祁海文）

四川大学“大学生创新创业训练计划”校级项目（20141006）