微波辅助提取杜仲翅果籽粕蛋白的工艺优化

杨志伟 王 珏 揭雅娇 沈 旭 麻成金 黄 群

YANG Zhi－wei WANG Jue JIE Ya－jiao SHEN Xu MA Cheng－jinHUANG Qun

（吉首大学食品科学研究所，湖南 吉首 416000）

（Institute of Food Science，Jishou University，Jishou，Hunan 416000，China）

杜仲又名思仲、扯丝皮、思仙、思连木、木棉、玉丝皮、丝绵木等，属杜仲科落叶乔木，是中国特有的经济树种［1，2］。杜仲在中国分布比较广，但主要分布在秦岭以南的贵州、四川、湖南、湖北等省份，种植面积达35万 hm2［3，4］。杜仲翅果，扁平，先端下，周围长有薄翅，内含种子1粒，扁平，线形长1.2～1.5 cm，宽3 cm［5］。杜仲翅果籽是提取杜仲油、杜仲胶的最佳原料，经提油、提胶后产生的籽粕中含丰富的蛋白质，含量约为28%～35%［6］。目前，对于杜仲翅果籽粕蛋白的研究较少，在一定程度上造成了杜仲翅果籽粕资源的浪费。黄群等［7］采用碱法提取杜仲翅果籽蛋白，提取率达到87.31%，但提取时间长、蛋白纯度低。微波作为一种新型的辅助提取手段，与传统的提取方法相比具有较高的选择性、萃取效率高、节约能源等优点［8，9］。将微波用于杜仲翅果籽粕蛋白的提取，既可提高产品纯度，缩短提取时间，还可弥补在该领域的空白。本课题主要探讨微波辅助碱提法提取杜仲翅果籽粕中的提取条件，为合理利用和开发这一资源提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

杜仲翅果籽粕：杜仲翅果籽经超临界CO2萃取油脂后的粕粉，经凯氏定氮法测定蛋白质含量为34.94%，湘西老爹生物公司；

凯氏定氮仪：KDN系列，浙江托普仪器有限公司；

数显恒温磁力搅拌器：HJ－3型，常州澳华仪器有限公司；

微波萃取仪：BXG1－XH－100B型，北京中西化玻仪器有限公司；

p H计：PHSJ－4A型，上海雷磁仪器厂；

离心机：LXJ－IIB型，上海安亭科学仪器厂；

电子天平：FA2003型，上海舜宇恒平科学仪器有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 工艺流程

杜仲翅果籽粕→加浸提液→调p H值→微波处理→上清液离心→调p H至等电点→离心分离→蛋白质沉淀→冷冻干燥→蛋白产品

1.2.2 提取方法 取杜仲翅果籽粕5.0 g，以一定料液比加入蒸馏水，用0.1 mol／L NaOH溶液调p H 值，置于微波萃取仪中处理。离心（5 000 r／min，15 min）过滤，所得上清液即为杜仲翅果籽粕蛋白提取液。以0.1 mol／L稀盐酸调上清液至蛋白完全沉淀，将所得沉淀真空冷冻干燥即得杜仲翅果籽粕蛋白。

1.2.3 试验设计 利用微波辅助碱提法，通过单因素试验分别考察p H值、料液比、微波功率、微波作用时间对杜仲蛋白提取率的影响。确定最适范围后，利用Central－Composite组合设计响应曲面试验优化提取条件。其单因素试验设计：

（1）提取液p H值对蛋白质提取率的影响：在料液比1∶25（m∶V）、超声波功率300 W、微波时间240 s的条件下，考察不同p H 值（7，8，9，10，11）对蛋白质提取率的影响，以确定其因素取值范围。

（2）料液比对蛋白质提取率的影响：在p H 9.0、微波功率300 W、微波时间240 s的条件下，考察不同料液比（1∶15，1∶20，1∶25，1∶30，1∶35（m∶V））对蛋白质提取率的影响，以确定其因素取值范围。

（3）微波功率对蛋白质提取率的影响：在p H 9.0、料液比1∶25（m∶V）、微波时间240 s的条件下，考察不同微波功率（120，180，240，300，360 W）对蛋白质提取率的影响，以确定其因素取值范围。

（4）微波时间对蛋白质提取率的影响：在p H 9.0、料液比1∶25（m∶V）、微波功率300 W的条件下，考察不同微波时间（80，160，240，320，400 s）对蛋白质提取率的影响，以确定其因素取值范围。

1.2.4 蛋白质提取率的测定

（1）提取液蛋白质含量的测定：采用考马斯亮蓝G－250法［10］。

（2）标准曲线的绘制：准确吸取牛血清蛋白标准溶液，加入考马斯亮蓝G－250溶液，通过可见光分光光度法，以吸光度为纵坐标Y，标准蛋白含量（μg／m L）为横坐标X，绘制的标准曲线见图1。

图1 标准曲线Figure 1 Standard curve

（3）蛋白质提取率计算：按式（1）计算。

1.2.5 数据处理 所得试验数据由 Design－expert8.0.5软件处理。

2 结果与讨论

2.1 微波辅助碱提－响应面因素的确定

在单因素试验结果基础上，采用Central－Composite设计，对p H值、料液比、微波功率、微波时间4个因素进行优化，各试验组的编码及取值见表1。

表1 响应面分析因素与水平表Table 1 Factors and levels of Response Surface Method

2.2 响应面试验及方差分析

利用Design Expert 8.0.5软件对表2进行二次响应面回归分析，得到如下多元二次响应面回归模型：

表3是响应面模型的方差分析结果。由表3可知，模型P值＜0.000 1，说明模型极显著，即试验数据与所采用的二次数学模型符合。失拟项P＝0.124 3＞0.05不显著，R2＝0.990 8，表明回归方程的拟合程度较好，试验误差小，可以用该模型分析和预测微波辅助提取杜仲翅果籽粕蛋白的工艺结果。依据回归方程系数显著性检验可知：模型一次项A、B、C、D极显著；二次项 A2、B2、C2、D2均处于显著水平；交互项AC极显著，AB显著，AD、BC、BD、CD均不显著。

2.3 响应曲面分析与工艺优化

等值线的形状可反映出交互效应的强弱，椭圆形表示两因素交互作用显著，而圆形则与之相反。由图2可知，当p H一定时，蛋白质提取率随着料液比的增加呈现出先增加后减小的趋势；当料液比一定时，蛋白质提取率随着p H的增大先增大而后趋于平缓；其等值线趋于椭圆，说明p H与料液比的交互作用显著。由图3可知，当p H一定时，蛋白质提取率随着微波功率的增加而增加，当微波功率达到一定值时，蛋白质提取随着微波功率的增大而呈现下降趋势；当微波功率一定时，蛋白质提取率随着p H的增大而先增大后趋于平缓；二者之间的等值线呈椭圆状，说明p H与微波功率交互作用显著。

表2 Central－Composite设计试验及结果Table 2 Design and results of Central－Composite experiment

对二次多项回归方程（式（2））取一阶偏导等于零。解得：A ＝0.54，B ＝ －0.29，C ＝0.09，D ＝0.07，即p H 值9.54，料液比1∶21.45（m∶V），微波功率305.40 W，微波时间245.60 s。考虑到试验的实际操作，微波辅助碱提法提取杜仲翅果籽粕蛋白的最佳条件为p H 9.5，料液比1∶22（m∶V），微波功率305 W，微波时间246 s，在该工艺条件下，模型预测蛋白质的提取率为60.34%。为了进一步验证杜仲翅果籽蛋白最优的微波辅助提取工艺，采用上述工艺条件进行了3次重复实验，结果蛋白质平均提取率为60.30%，与理论值基本一致。

表3 回归模型的方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

表3 回归模型的方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

＊＊表示极显著（P＜0.01）；＊表示显著（0.01＜P＜0.05）。

来源 离差平方和自由度 均方 F值 P值 显著性模型 629.30 14 44.95 115.55 ＜0.000 1 ＊＊A 65.86 1 65.86 169.29 ＜0.000 1 ＊＊B 33.73 1 33.73 86.70 ＜0.000 1 ＊＊C 9.72 1 9.72 25.00 0.000 2 ＊＊D 6.54 1 6.54 16.81 0.000 9 ＊＊AB 2.12 1 2.12 5.46 0.033 7 ＊AC 4.48 1 4.48 11.53 0.004 0 ＊＊AD 0.86 1 0.86 2.21 0.157 7 BC 0.018 1 0.018 0.045 0.834 6 BD 0.072 1 0.072 0.18 0.674 1 CD 0.44 1 0.44 1.13 0.305 0 A 2 6.80 1 6.80 17.49 0.000 8 ＊＊B2 10.52 1 10.52 27.05 0.000 1 ＊＊C2 15.05 1 15.05 38.69 ＜0.000 1 ＊＊D2 28.91 1 28.91 74.31 ＜0.000 1 ＊＊失拟项 4.98 10 0.50 2.92 0.124 3残差 0.85 5 0.17总和 635.14 29

图2 p H（A）与料液比（B）对蛋白质提取率（Y）影响的响应面与等值线Figure 2 Response surface and contours of the effect of p H values and ratio of material to liquid on protein extraction yield

图3 p H（A）与微波功率（C）对蛋白质提取率（Y）影响的响应面与等值线Figure 3 Response surface and contours of the effect of p H values and microwave power on protein extraction yield

3 结论

通过单因素试验，确定各因素的最适范围，利用中心组合设计－响应面分析法对p H值、料液比、微波功率、微波时间4个因素对杜仲蛋白提取率的影响进行分析。最终确定微波辅助提取的最适条件为p H 9.5，料液比1∶22（m∶V），微波功率305 W，微波时间246 s。该工艺条件下的杜仲翅果籽粕蛋白质提取率为60.30%。该工艺与传统方法［7］相比，提取率有所下降，可能是温度的瞬间升高而使蛋白质变性。采用微波辅助碱法提取杜仲翅果籽粕蛋白，提取时间短，效率高，且操作简易。但提取过程中酸碱的使用对蛋白质的纯度和质量均有一定不良影响，杜仲翅果籽粕中含量丰富的桃叶珊瑚甙对杜仲蛋白颜色的影响也尤为显著。因此制取纯度高色泽好的杜仲翅果籽粕蛋白，须去除原料中的桃叶珊瑚甙并对提取的粗蛋白进行透析处理。

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