脑毒清颗粒对大鼠脑缺血再灌注损伤后IL-6和TNF-α含量的影响*

曲 颖 王 巍 贾维刚△ 王加志

（1.黑龙江省医院，黑龙江 哈尔滨 150001；2.黑龙江省中医药科学院，黑龙江 哈尔滨 150001；3.黑龙江中医药大学佳木斯学院，黑龙江 佳木斯 154000）

脑毒清颗粒对大鼠脑缺血再灌注损伤后IL-6和TNF-α含量的影响*

曲 颖1王 巍2贾维刚2△王加志3

（1.黑龙江省医院，黑龙江 哈尔滨 150001；2.黑龙江省中医药科学院，黑龙江 哈尔滨 150001；3.黑龙江中医药大学佳木斯学院，黑龙江 佳木斯 154000）

目的 观察脑毒清颗粒对脑缺血再灌注损伤的保护作用。方法 大鼠随机分为对照组、假手术组、模型组和脑毒清组，采用线栓法（MCAO）制备大鼠大脑中动脉栓塞模型，2h后抽取线栓对大鼠进行脑缺血再灌注，研究脑毒清颗粒对脑缺血再灌注神经功能缺损、脑梗死体积、血清中白细胞介素（IL-6）和肿瘤坏死因子（TNF-α）含量的影响。结果 脑毒清颗粒能减少MCAO神经功能缺损评分和脑梗死体积，降低血中IL-6和TNF-α含量。结论 脑毒清颗粒对大鼠脑缺血再灌注损伤有一定保护作用。

脑毒清颗粒 缺血再灌注损伤 白细胞介素-6 肿瘤坏死因子-α

随着缺血性脑损伤机制研究的不断深入，脑缺血早期的炎症反应及其损伤日益受到关注［1］。白细胞介素6（IL-6）通过多种方式参与缺血再灌注损伤过程。炎性介质肿瘤坏死因子α（TNF-α）在脑缺血再灌注损伤中具有重要作用。本实验制作脑缺血再损伤模型（MACO），观察脑毒清颗粒对IL-6、TNF-α的影响，以研究脑毒清颗粒对脑缺血灌注损伤的保护作用机制。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验材料 健康雄性SD大鼠80只，体质量（300±20）g，由哈尔滨市实验动物中心提供（2011007018）。脑毒清颗粒剂（由黑龙江省中医研究院药剂室提供）；IL-6、TNF-α定量ELISA试剂盒（北京环亚泰克生物医学技术有限公司）；考马斯亮蓝蛋白定量试剂盒（南京建成生物工程研究所）；其他试剂均为国产分析纯。仪器：高速冷冻离心机（D-37520型，德国Heraeus公司）；Multiskan MK3型酶标仪（芬兰Thermo Labsystems公司）；轮转式石蜡切片机（德国LEICARNZ135）；光学显微镜（OLYMPUS）；医学图像分析系统Bl-2000（成都泰盟科技有限公司）；数显式电热恒温箱（上海跃进仪器厂）。

1.2 实验方法 动物分组及给药方法：将大鼠随机分为4组，即对照组10只、假手术组10只、模型组和脑毒清组各30只，模型组和脑毒清组按灌注时间分为12h、24h、48h 3个亚组，每组10只，同时各组在脑缺血再灌注12h时再行TTC染色观察脑梗死体积。脑毒清组以60mg/（kg·d）灌胃，模型组和假手术组给予等量0.9％氯化钠注射液。连续给药7d，末次给药30min后，对大鼠进行右侧大脑中动脉阻塞模型手术。右侧大脑中动脉阻塞（MACAO）模型制作，参照稍加改良的Longa法［2］。

1.3 观察指标 神经功能缺损体征评分：MACO术后（大鼠意识恢复后30min）对脑缺血大鼠神经功能缺陷进行评分。按Longa 5分法进行［3］。其中1～3分者纳入研究。大鼠脑梗死体积的测定：10％水合氯醛深麻醉下，快速开胸暴露心脏，经升主动脉快速灌注37℃肝素化0.9％氯化钠注射液250mL以移除血液，断头取脑，将脑放入-20℃冰箱冷冻10min至脑变硬，从大脑半球额极至枕极用切脑模具连续冠状切片6片，每片厚2mm。将脑片小心放入2％TTC磷酸缓冲液中，37℃避光孵育30min，继续将脑片置于4％多聚甲醛的0.1mmol/L磷酸缓冲液中避光后固定24h，数码相机拍照。经TTC染色后，正常脑组织由于线粒体琥珀酸脱氢酶正常而被染成粉红色，梗死区该酶活性丧失而呈苍白色，界限分明，利用图像分析软件分别测出梗死面积及缺血侧半球面积，梗死体积=梗死面积×厚度。为减小操作误差及水肿的影响，以相对梗死面积，即梗死体积占半球体积百分比（V％）表示，V％=梗死体积/缺血半球体积×100％。血浆IL-6、TNF-α的测定：假手术组于麻醉前及假手术后12h眼窝取血。模型组及脑毒清组于MCAO前眼窝取血，术后各时间点断头取血。柠檬酸钠作为抗凝剂，混合10min后离心，分离血浆备用。严格按说明书操作，用酶标仪测定吸光度，通过标准曲线计算血浆中IL-6、TNF-α浓度。

1.4 统计学处理 应用SPSS11.0统计软件。实验数据以（±s）表示，多组间数据比较采用方差分析，两组间比较采用t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 脑毒清颗粒对大鼠神经功能的影响 见表1。缺血再灌注术后，模型组动物表现出明显神经运动功能障碍，而脑毒清组大鼠神经功能缺损症状均获不同程度改善（P＜0.05或P＜0.01）。

表1 MCAO大鼠术后神经功能评分（分，±s）

表1 MCAO大鼠术后神经功能评分（分，±s）

脑毒清组与模型组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01。下同。

组 别 术后24 h 术后48 h模型组 3.65±0.51 3.96±1.38脑毒清组 3.02±0.12△ 2.67±0.67△△n 术后12 h 10 3.19±0.21 10 3.11±0.02△

2.2 脑毒清颗粒对大鼠脑梗死体积的影响 见图1。TTC染色结果可见，假手术组经TTC染色后脑片全红，模型组大鼠右侧额顶叶皮质及纹状体可见明显的白色梗死灶，脑毒清组与模型组比较梗死面积明显减小。

2.3 脑毒清颗粒对大鼠血浆IL-6、TNF-α含量的影响 见表2，表3。模型组IL-6、TNF-α含量显著高于假手术组（P＜0.01）。脑毒清组与模型组比较，IL-6、 TNF-α含量显著降低（P＜0.01）。结果提示脑毒清颗粒可以减少大鼠炎性因子IL-6、TNF-α的生成，对炎症损伤有保护作用。

图1 脑毒清组与模型组梗死面积比较

表2 各组大鼠血浆IL-6含量（μg/L，±s）

表2 各组大鼠血浆IL-6含量（μg/L，±s）

与模型组相应时间点比较，△P＜0.01，下同。

组 别 术后24 h 术后48 h假手术组n 10术前 术后12 h 143.5±15.8 148.6±16.3模型组 223.6±26.8 186.4±21.7 10 146.7±20.7 236.0±17.5脑毒清组 10 136.9±21.0△199.6±10.6△186.3±13.2△167.4±16.3△

表3 各组大鼠血浆TNF-α含量（μg/L，±s）

表3 各组大鼠血浆TNF-α含量（μg/L，±s）

组 别 术后24 h 术后48 h假手术组n 10术前 术后12 h 83.9±13.0 81.7±14.3模型组 142.1±26.7 121.4±15.7 10 84.7±12.9 159.3±15.5脑毒清组 10 82.2±9.7△126.9±11.6△ 114.3±11.2△106.0±14△

3 讨论

脑梗死后缺血区的炎症反应主要表现在白细胞聚集、溶酶体破坏、水解酶生成、氧自由基产生、炎症介质形成等方面。脑缺血再灌注后内皮细胞炎症反应使血脑屏障受损，加重了脑损害及脑水肿，此病理生理过程的基础是以TNF-α、IL-1β、IL-6等细胞因子为代表的多种炎性介质失控、释放而形成的“瀑布效应”［5］。因此阻断炎症反应是治疗缺血性脑血管疾病的一个重要策略。IL-6由T细胞、成纤维细胞、单核细胞、巨噬细胞、内皮细胞等产生，具有广泛生物学功能，参与机体免疫应答和炎症反应。目前认为IL-6是急性缺血期脑损伤程度的一个标志［6］。TNF-α是与炎症及免疫反应有关的巨噬细胞分泌的一种细胞因子。在脑缺血早期TNF-α分泌或合成的增加是脑梗死形成的主要原因［7］，它具有增加血管内皮细胞的通透性，诱导细胞黏附因子表达等作用。TNF-α在脑缺血后诱发的白细胞浸润和组织损伤中起重要作用，可引起多核白细胞聚集和激活并释放炎症介质。因此，通过各种措施阻断TNF-α的表达可减少缺血性神经元损伤。TNF-α还可激活其他细胞产生多种细胞因子，如诱导IL-6的合成等。

本研究发现，脑毒清颗粒可有效抑制脑缺血再灌注后TNF-α和IL-6含量的增加（P＜0.01），提示上述炎性细胞因子参与了脑缺血再灌注的损伤过程。脑毒清颗粒抑制了TNF-α、IL-6的表达，从而抑制再灌注后的炎症反应，缩小缺血再灌注后脑梗死体积，改善神经功能缺损评分。表明脑毒清颗粒对缺血性神经损伤具有保护作用。同时说明应用MCAO模型确切可靠。结合既往研究表明，脑毒清颗粒对脑缺血再灌注损伤的保护作用是多途径、多靶点的。

［1］Frangogiannis NG，Smith CW，Entman M.The inflammatory response in myocardial infarction［J］.Cardiovasc Res，2002，53（1）：31-47.

［2］历建元，张亚卓，姚伟成，等.两种方法制作大鼠大脑中动脉栓塞再灌注模型比较［J］.青岛大学医学院学报，2008，44（5）：382-384.

［3］张家良，张小燕.头针对急性脑卒中的临床疗效［J］.中国康复，2007，22（2）：121-121.

［4］周利，张红星，刘灵光，等.头针对急性脑缺血再灌注大鼠促炎性反应因子TNF-α、IL-1β含量的影响［J］.针刺研究，2008，33（3）：173-175.

［5］韩绍娟，刘志龙.补阳还五汤对沙土鼠脑缺血再灌注损伤后血清炎性细胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α的影响［J］.实用中西医结合临床，2004，4（4）：1-3.

［6］Clark WM，Rinker LG，Lessov NS，et al.Lack of interleukin-6expression is not protective against focal central nervous system ischemia［J］.Stroke，2000，31（7）：1715-1720.

［7］Sairanen T，Carpen O，Karjalainen-Lindsberg ML，et al.Evolution of cerebral tumor necrosis factor production during human ischemic stroke［J］.Stroke，2001，32（8）：1750-1758.

Effects of Naoduqing Granules on IL-6 and TNF-α Contents in Model Rats with Cerebral Ischemia-Reperfusion Injury

QU Ying，WANG Wei，JIA Weigang，et al.
Provincial Hospital of Heilongjiang，Heilongjiang，Harbin 150001，China

Objective：To study the protective effects of Naoduqing granules on cerebral ischemia/reperfusion damage.Methods：Rats were randomly divided into control group，sham operation group，model group，and Naoduqing granules group.Animal model of focal cerebral ischemia was established by using suture method in mature SD rats.The neurological severity scores as well as the activity of IL-6 and TNF-α in brain tissue of cerebral ischemia were detected.Results：In compared with the model group，the level of IL-6 and TNF-α were decreased with significant statistical differences in treatment group.Conclusion：Naoduqing granules have obvious ameliorating effect on focal cerebral ischemia in rats，which is caused by reduction of IL-6 and TNF-α contents.

Naoduqing granules；Cerebral ischemia-reperfusion injury；IL-6；TNF-α

R289.9

A

1004-745X（2014）10-1823-03

10.3969/j.issn.1004-745X.2014.10.019

2014-05-28）

黑龙江哈尔滨市青年科技创新人才研究专项资金项目（2010RFQYS084）

△通信作者