通窍开玄法对鼻窦炎模型大鼠鼻黏膜影响的分子机制研究*

敬 樱 赵 静 张天娥 罗再琼

（成都中医药大学基础医学院，四川 成都 611137）

·研究报告·

通窍开玄法对鼻窦炎模型大鼠鼻黏膜影响的分子机制研究*

敬 樱 赵 静△张天娥 罗再琼

（成都中医药大学基础医学院，四川 成都 611137）

目的 应用基因芯片技术观察通窍开玄法对鼻窦炎模型大鼠鼻黏膜通路及基因表达的影响，探讨其治疗鼻窦炎的分子机制。方法 SD大鼠随机分为实验组、模型组和正常组，实验组和模型组。依据Y.Gel的改良方法造模，正常组不做任何处理。造模成功后实验组分为中药组与青霉素V钾片组，分别予苍耳子鼻炎胶囊、青霉素V钾片灌胃，处死动物，取鼻黏膜组织，应用基因芯片检测各组大鼠鼻黏膜基因表达，筛选差异表达基因和通路并进行统计分析。结果 中药组与青霉素V钾片组治疗效果相似；中药组和青霉素V钾片组分别与模型组比较：中药组得到的差异基因及通路改变均多于青霉素V钾片组；两组共同涉及13条通道，且共同上调8条基因、下调71条基因。结论 通窍开玄法对治疗鼻窦炎大鼠存在物质基础，可为临床治疗鼻窦炎提供新的治疗思路。

鼻窦炎 基因芯片 通窍开玄法 基因通路表达

玄府广泛存在于鼻腔鼻窦的黏膜，其有序的开阖维持着气液在鼻腔鼻窦黏膜的循环交通，保证了鼻腔鼻窦黏膜的正常形态及生理功能［1］。而外邪入侵、邪毒内生郁阻鼻中窦窍与玄府，导致双窍闭塞是鼻窦炎发病的重要机制。本课题组前期研究显示，运用通窍开玄法治疗鼻窦炎模型大鼠效果显著，但是未从基因水平探讨其作用机制。因此，本研究应用基因芯片技术，从基因水平探讨开窍通玄法对鼻窦炎模型大鼠鼻黏膜作用的分子机制，揭示通窍开玄法治疗鼻窦炎的生物学机制，为通窍开玄法提供新的实验依据。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SD大鼠40只，雌雄各半，体质量200～250g，由成都中医药大学动物实验中心提供。

1.2 试剂与仪器 苍耳子鼻炎胶囊：四川禾邦制药有限责任公司生产，规格每粒装0.4g，市售（人用量每次2粒，每日3次），据实验动物体质量及动物给药原则计算药物用量。青霉素V钾片：市售［5～18.7mg/（kg·d）］。TRIZOL Reagent（Cat#15596-018，Life technologies，Carlsbad，CA，US）、RNeasyminiKit（Cat#74106，QIAGEN，GmBH，Germany）、RNase-free DNase set（Cat#79254，QIAGEN，GmBH，Germany）、Low Input Quick Amp Labeling Kit（Cat#5190-2305，Agilent technologies，Santa Clara，CA，US），One-Color、RNASpike-InKit（Cat#5190-2305，Agilent technologies，Santa Clara，CA，US）、One-Color、Gene Expression Kit（Cat#5188-5242，Agilent technologies，Santa Clara，CA，US）、Gene Expression Wash Buffer Kit（Cat#5188-5327，Agilent technologies，Santa Clara，CA，US）。AgilentBioanalyzer2100（Agilent technologies，Santa Clara，CA，US）、Hybridization oven（Cat#G2545A，Agilenttechnologies，SantaClara，CA，US）、staining dishes（Cat#121，Thermo Shandon，Waltham，MA，US）、Agilent Microarray Scanner（Cat#G2565CA，Agilent technologies，Santa Clara，CA，US）。

1.3 造模与分组 实验SD大鼠40只，适应性饲养1周后，参考相关文献［2］的方法，随机取30只大鼠，按0.5mg/kg腹腔注射氯胺酮全身麻醉，同时用利多卡因1.52～2.0mL（20mg/mL）配肾上腺素0.0125mg，鼻背下浸润麻醉，在面中线上中1/3交界处旁3mm以45度角作切口，塞入带有金葡萄球菌的明胶海绵于内，缝合切口，建立急性鼻窦炎大鼠模型。

1.4 实验方法 造模后第7日，将造模大鼠随机分为中药组、青霉素V钾片组、模型对照组各10只。10只大鼠为正常空白对照组。从造模成功后的第1日开始灌胃连续7d，每日各组均早晚两次灌服。中药组以相当于临床成人剂量10倍的药物制成混悬液灌胃［即5mL/（kg·d）］；青霉素V钾片组，每日以相当于临床成人剂量5倍的青霉素V钾片制成混悬液灌胃［含药量10mg/（kg·d）］。模型对照组以等量0.9％氯化钠注射液灌胃。正常对照组不灌胃，常规喂养。于灌胃结束后次日处死大鼠，在超净台冰盘上摘取鼻黏膜组织，无Rnase PBS缓冲液冲洗两次，放入冻存管，置液氮罐保存，备提取RNA。根据试剂盒说明书RNeasymini kit（Cat#74106，QIAGEN，GmBH，Germany）和RNase-Free DNase Set（Cat#79254，QIAGEN，GmBH，Germany）提供的标准操作流程进行样品的总RNA抽提，并纯化总RNA，经安捷伦2100芯片生物分（Agilenttechnologies，Santa Clara，CA，US）电泳质检。质检合格的RNA进行单荧光标记，利用Agilent大鼠全基因4×44K芯片检测，依次进行芯片杂交、洗涤，采用安捷伦芯片扫描仪进行扫描获取荧光信号。用Feature Extraction software 10.7（Agilent technologies，Santa Clara，CA，US）采转换荧光信号为数值，最后采用Gene Spring Software 11.0进行归一化处理，所用的算法为Quantile，获取各组基因表达值。

1.5 统计学处理 用Excel计算实验组与模型对照组基因表达ratio值，通常设定差异倍数的阈值为小于0.5或大于2为基因差异评判标准，大于2表示基因上调2倍，小于0.5表示基因下调2倍。分析显示，实验组与模型对照组相比：中药组得到4583条差异基因，青霉素V钾组得到352条差异基因。

2 结果

2.1 聚类分析 利用斯坦福大学Clustr和Treeview软件，过滤数据，以At least 1 observations with abs=4.0，MaxVal-MinVal＞=1.0可以清楚看到cDNA微阵列中8676个基因在中药组（ARRY0X）、青霉素V钾片组（ARRY01X）、模型组（ARRY02X）和空白组（ARRY03X）比较后的基因表达情况，其中每个小格代表一个基因，黑色表示无差异，红色表示上调，绿色表示下调，颜色的变化程度与基因表达的差异性成正比。从图1中可以看出中药组和青霉素V钾片组聚类，说明中药组治疗鼻窦炎大鼠与青霉素V钾片组治疗效果相似。

图1

2.2 开窍通玄法所涉及差异表达基因参与通路分析 利用KEGG数据库分析差异表达基因生物学通路，中药组差异基因涉及278条通路改变，青霉素V钾片组差异基因涉及193条通路改变，主要包括炎症发生、抗原提呈、补体等免疫学通路等。涉及通路名称及基因条数如表1所示。从表1可看出，两组差异表达基因涉及相同的通路，也涉及不同的通路，在同一通路中，表达的基因条数也不同。

表1 两组差异表达基因分别涉及通路改变及基因数目表

2.3 开窍通玄法所涉及差异基因的功能分析 本研究采用Babelomics 4.3数据库进行分析，对两组差异表达基因分别进行GO生理过程（BP）、分子功能（MF）和细胞组分（CC）分析，两组间参与BP差异表达基因数量百分比有统计学意义如图2、图3所示（P＜0.05）；两组中共有基因表达差异比较如表2、3所示；两组的差异表达基因共同BP如表2、3所示。

图2 两组上调差异基因共同参与生理过程分析图

图3 两组下调差异基因共同参与生理过程分析图

表2 两组中共有上调基因差异表达值表

3 讨论

鼻中玄府作为遍布鼻腔、鼻窦的一种微观结构，维持着鼻部气液的流通、神机的运转，对于保证鼻的功能至关重要。不论外邪的侵袭，七情的失调，饮食劳倦所伤，气血津液失养，均可影响其正常的畅通而致闭密，成为鼻部诸多疾病所共有的基本病理变化。鼻窦窦窍与鼻玄府的双重闭塞、内外双毒交互搏结是形成鼻窦炎的主要原因。治疗上应以通窍开玄，以“通鼻窍、开玄府”为治疗原则。苍耳子鼻炎胶囊主要成分为苍耳子，其为风药，可辛散透达、开泄宣通，具有开启腠理孔窍、宣通郁结闭塞之功，能疏通各种瘀滞，使郁闭之孔窍开张畅达，阻滞之气血津液精神畅通，从而可有效治疗鼻窦炎。

表3 两组中共有下调基因差异表达值表

实验结果发现中药组和青霉素V钾片均可上调syndecan-4（Sdc4）基因，下调ALOX5、S100A8、S100A9基因，但中药组上下调表达更明显。syndecan-4可独立通过激活PKCa激活小G蛋白Rho（ras homologus oncogenes）超家族（包括RhoA、Racl、RhoG等），调节细胞骨架蛋白重排。syndecan-4多聚化并激活PKCa后，可促使Rho二磷酸鸟苷解离抑制因子（RhoGDI）中Ser96磷酸化，释放与之结合的RhoG并激活Racl［3］。Rac蛋白的SH3区通过与波形蛋白相互作用，激活肌动蛋白相关蛋白2/3（Arp2/3）复合体，促进肌动蛋白（actin）聚合，参与细胞移行过程中片状伪足的形成；而释放的RhoG可以促使整合素α5β1内吞，抑制细胞黏附，促进细胞移行和创伤组织修复［4］。除了肌动蛋白外，α-辅肌动蛋白（α-actinin）作为细胞骨架的重要组成部分可直接与syndecan4胞内段的V区关联，影响微丝束的重组，调控细胞的黏附和移行［5］。本实验推测，经过中药组治疗后上调syndecan-4（Sdc4）基因的表达，促进激活RhoG，从而抑制了细胞黏附，促进细胞移行和创伤鼻黏膜组织修复过程。

ALOX5基因编码的花生四烯酸5-脂氧合酶（5-LO）是炎症介质白三烯（LTs）生成旁路的一个起始催化酶，在炎症、老年性痴呆、肿瘤和过敏等疾病中5-LO的活性及其表达通常升高，使LTs类代谢产物的生物合成增加，LT产物具有多种生物学功能，在疾病的发生发展中起重要作用，花生四烯酸在5-LO及5-脂氧合酶激活蛋白（5-FLAP）的作用下转化为5-过氧化氢廿碳四烯酸（5-HPEIE），5-HPEIE在酶的催化作用下依次生成LTA4、LTB4、LTC4、LTIM，LTIM进一步代谢为半胱氨酸衍生物LTE4［6］。白三烯是引起支气管哮喘发生重要的炎症介质［7］，由嗜酸粒细胞、肥大细胞和巨噬细胞生成，它可以引起气道平滑肌收缩和增生，促使嗜酸粒细胞和中性粒细胞募集，释放阳离子蛋白损伤上皮细胞，增加黏液分泌，降低纤毛转运能力，增加血管通透性，促进气道重塑［8］。

S100A8/S100A9的主要功能是抑制酪蛋白激酶（casein kinase）I和Ⅱ的活性，酪蛋白激酶I和Ⅱ是正常转录和翻译过程中分子水平磷酸化必不可少的［9］。S100A9在炎症部位通常和S100A8形成一种稳定的异源二聚体（S100A8/A9），对炎症灶周围的白细胞具有很强的趋化作用［10］。苍耳子鼻炎胶囊通过上调syndecan-4（Sdc4）基因，下调ALOX5、S100A8、S100A9基因可能是治疗鼻窦炎机制之一。

综上可见，本次实验利用基因芯片首次对通窍开玄法治疗鼻窦炎大鼠的分子机制进行研究，发现苍耳子鼻炎胶囊与青霉素V钾片治疗鼻窦炎大鼠具有相似的实验效果。通过对差异表达基因生物信息学分析发现，二者既通过不同的生物学通路和基因发挥作用，又通过相同生物学过程与同一基因的差异表达调控发挥作用，但是中药组表达调控更强更广一些，体现了中药多靶点调控和作用成分复杂特点。总之，苍耳子鼻炎胶囊能在基因表达水平，从多途径、多环节、整体上调控炎症过程，揭示其治疗鼻窦炎的生物学基础，充分证明了开窍通玄法的科学性，为防治鼻科疾病开辟了新途径。

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Effects of Tongqiaokaixuan Method on the Molecular Mechanism of Nasal Mucosa in Sinusitis Rat Model

JING Ying，ZHAO Jing，ZHANG Tiane，et al.
Chengdu University of TCM，Sicuan，Chengdu 611137，China

Objective：To observe the effect of Tongqiaokaixuan method on the gene passway and expression of nasal mucosa in sinusitis rat model by the technique of gene chip.Methods：SD rats were randomly divided into experimental groups，model group and normal group.Experimental groups and model group adopted Y.Gel improved model while normal group changed nothing.After success of model building，experimental groups were given Xanthium rhinitis capsule and Penicillin V potassium tablets respectively by gavage.Then the rats were put to death.Nasal mucosal tissue extracts were detected by gene chip to show the gene expressions.Differentially expressed genes and pathways were screened and statistically analyzed.Results：Penicillin V potassium tablets group and TCM group shared some similarities.TCM group changed more of gene expressions and passways than penicillin V potassium tablets group.The two groups have 13 common passways in physiological processes，and the common process raised 8 genes and decreased 71 genes.Conclusion：Tongqiaokaixuan method has certain effect on rats with sinusitis thus provides new way for clinical treatment of sinusitis.

Sinusitis；Gene chip；Tongqiaokaixuan method；Gene passway

R765.4+1

A

1004-745X（2014）10-1773-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2014.10.001

2014-05-19）

国家自然科学基金资助项目（81072737）；成都中医药大学校基金资助项目（ZRYB200924）

△通信作者