灵芝多糖对糖尿病大鼠胸主动脉氧化应激的影响

冯艳，乔进*，陈惠，郑惠华

1南通市第三人民医院药剂科，南通　226006；2江苏安惠生物科技有限公司，南通　226001

灵芝多糖对糖尿病大鼠胸主动脉氧化应激的影响

冯艳1，乔进1*，陈惠2，郑惠华2

1南通市第三人民医院药剂科，南通226006；2江苏安惠生物科技有限公司，南通226001

摘要目的：研究灵芝多糖对链脲佐菌素（STZ）诱导的糖尿病大鼠胸主动脉内皮损伤的保护作用及对糖尿病大鼠胸主动脉氧化应激的影响。方法：SD大鼠经过4周高脂饮食后腹腔注射链脲佐菌素（30 mg·kg-1）造模，随机分为正常对照组、模型组、灵芝多糖（GLPs）高、低剂量组。经过12周给药治疗后，测定血清中过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）、总胆固醇（TC）和甘油三酯（TG）的水平；然后胸主动脉切片HE染色，观察胸主动脉超微结构及病理改变。结果：GLPs-H组血糖浓度较模型组相比均明显下降（P＜0.01），血清CAT和GSH-PX水平较模型组相比均明显上升（P＜0.01）；血清TC、TG含量较模型组相比均明显下降（P＜0.01）。HE染色，与模型组相比，GLPs-H组光镜下主动脉内膜增厚、内皮损伤、中膜增厚的情况有所改善。结论：灵芝多糖可减轻糖尿病大鼠体内氧化应激水平，具有减轻脂质过氧化作用，对糖尿病胸主动脉并发症的发生发展有一定的预防作用。

关键词灵芝多糖；糖尿病；氧化应激

糖尿病是多种病因引起的一种慢性高血糖为特征的代谢紊乱，是由于体内胰岛素绝对或相对不足或靶组织对胰岛素不敏感而引起的糖、脂肪、蛋白质代谢紊乱的疾病[1-2]。灵芝多糖（Ganoderma lucidumpolysaccharide，GLPs）是从灵芝中提取的有效活性成分，具有广泛的药理活性[3]。乔进[4]等发现灵芝多糖可通过增强体内氧化应激来保护大鼠主动脉内皮依赖性舒张反应。

本研究给予2型糖尿病大鼠灵芝多糖，观察灵芝多糖对糖尿病大鼠胸主动脉内皮损伤的保护作用及对糖尿病大鼠体内氧化应激的影响。

1　材料和方法

1.1药品、仪器与动物

灵芝多糖：江苏安惠生物科技有限公司，纯度74.03%（批号：100601）；链脲佐菌素（streptozotocin，STZ）：Sigma公司，临用前用0.1 mol·L-1的柠檬酸缓冲液配成浓度为1%的STZ溶液；甘油三酯和总胆固醇试剂盒购自上海荣盛生物技术有限公司；过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶试剂盒购自南京建成生物工程公司；BH-NIC-B型倒置显微镜购自日本Olympus公司。

大鼠均购自南通大学实验动物中心〔使用许可证号：FYXK（苏）2007-0021〕，分笼喂养，自由饮水。

1.2方法

1.2.1试验设计与分组采用健康SD大鼠40只，雌雄各半，体重为160～180 g，分为正常对照组和造模组。正常组（N）10只：每天用生理盐水灌胃一次，正常饮食；造模组30只高脂饮食（饲料配方：脂肪20%、奶粉5%、蛋黄粉5%、基础饲料70%）喂养4周后造模（腹腔注射链脲佐菌素30 mg·kg-1），成模大鼠取30只随机均分为3组：①模型组（DM）：每天用生理盐水灌胃一次。②灵芝多糖低剂量组（GLPs-L），200 mg·kg-1；③灵芝多糖高剂量组（GLPs-H），800 mg·kg-1；灌胃给药12周。大鼠分笼喂养，自由饮水，正常组普通饲料喂养，其余3组均高脂饮食。

1.2.2过氧化氢酶（CAT）活力测定测定原理为CAT分解H2O2的反应可通过加入钼酸铵而迅速终止，剩余的H2O2与钼酸铵作用产生一种淡黄的络合物，在405 nm处测定其生成量，可计算出CAT的活力。具体操作方法按试剂盒说明书进行，血清CAT活力以每毫升血清每秒钟分解1 μmol的H2O2的量为一个活力单位。

1.2.3谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）含量的测定谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）可以促进H2O2与还原型谷胱甘肽（GSH）反应生成H2O及氧化型谷胱甘肽（GSSG），谷胱甘肽过氧化物酶的活力可以用酶促反应的速度来表示，测定此酶促反应中GSH的消耗，则可求出酶的活力。具体操作方法按试剂盒说明书进行，血清GSH-PX含量规定每0.1 mL血清在37℃反应5 min，扣除非酶促反应作用，使反应体系中GSH浓度降低1 μmol为一个酶活力单位。

1.2.4血清TC、TG含量测定实验16周后，大鼠禁食12 h，20%乌拉坦腹腔注射麻醉，颈动脉插管取血，2000 r·min-1分离血清，使用日立7170A全自动生化分析仪测定血清中甘油三酯（TG）、总胆固醇（TC）。

1.2.5HE染色甲醛固定胸主动脉后，用石蜡包埋，切片，常规HE染色，选取标准横切面的切片进行光镜观察。

1.3统计学分析

采用Stata7.0统计软件分析处理数据，计量资料数据用均数±标准差（±s）表示，多个样本均数的比较用单因素方差分析，均数两两比较用q检验，检验结果P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1糖尿病大鼠空腹血糖测定

给药12周末，禁食14～16 h后，经尾静脉取血测空腹血糖。GLPs高低剂量组血糖浓度较DM模型组相比均明显下降（P＜0.01），见表1。

表1　大鼠空腹血糖水平

2.2血清过氧化氢酶及谷胱甘肽过氧化物酶水平

STZ造模后，DM模型组血清CAT水平、GSHPX水平均明显下降（与N组相比，P＜0.01）；与DM组相比，给药后GLPs-H组CAT水平、GSH-PX水平明显上升（P＜0.01），见表2。

2.3血清总胆固醇和甘油三酯水平

STZ造模后，DM组血清TC、TG水平均明显升高（与N组相比，P＜0.01）；给药后GLPs-H组较DM模型组相比均明显下降（P＜0.01），见表3。

2.4HE染色

实验结束时，光镜下观察各组大鼠主动脉HE染色结果。N组：内膜薄而均一，表面光滑，内皮细胞形态规则，排列整齐，中膜无增厚，平滑肌细胞排列规则；DM组：内膜增厚明显，表面不光滑，内皮细胞突起，形态不规则，中膜明显增厚，平滑肌细胞排列紊乱；GLP-L组：形态比DM组略微好转，中膜未见明显增厚；GLPs-H组：内膜局限性增厚，内皮细胞排列较整齐，中膜增厚不明显，平滑肌细胞排列较整齐，程度较DM组明显减轻（见图1）。

表2　大鼠血清过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶水平（±s，n=10）

表2　大鼠血清过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶水平（±s，n=10）

与N组相比，a为P＜0.01；与DM组相比，b为P＜0.01

组别血清GSH-PX（酶活力单位）N组2618.43±336.05DM组1332.10±259.47aGLPs-L组1668.25±216.53GLPs-H组2236.20±270.51b剂量（mg·kg-1）血清CAT（U·mL-1）-13.57±3.204.02±0.95a2008.21±0.7580012.09±1.74b

表3　大鼠血清总胆固醇和甘油三酯水平（±s，n=10）

表3　大鼠血清总胆固醇和甘油三酯水平（±s，n=10）

与N组相比，a为P＜0.01；与DM组相比，b 为P＜0.01

组别TG（mmol·L-1）N组0.55±0.18DM组1.51±0.26aGLPs-L组1.37±0.14GLPs-H组1.06±0.15b剂量（mg·kg-1）TC（mmol·L-1）-1.33±0.256.23±0.51a2005.46±0.228004.54±0.38b

图1　各组大鼠胸主动脉HE染色（200×）

3　讨论

长期的高血糖引起全身多系统的代谢障碍，导致大血管和微血管的病变，严重影响了糖尿病患者的生活质量，甚至危及生命。本研究结果表明，通过灵芝多糖12周的干预，糖尿病大鼠的血糖明显的降低，提示灵芝多糖可能对糖尿病大鼠胰岛β细胞的损伤有一定的修复作用，促进胰岛素的分泌，从而使血糖降低。近10年来，国内外研究表明，氧自由基代谢参与了糖尿病的发生和发展，实验性糖尿病大鼠体内存在着明显的脂质过氧化现象。氧化应激及炎症反应在糖尿病发生发展中起重要作用[5]。干预氧化应激既可以消除病因，如恢复血糖、血脂水平；也可从病理环节着手，如切断氧化应激发生、消除氧化应激产物等。在体内高糖环境下，机体一方面清除氧自由基酶（CAT，GSH-Px）的活性降低；另一方面体内的氧化应激作用增强，造成了大量氧自由基在体内积聚，导致活性氧连锁反应，从而促进一系列糖尿病并发症的发生和发展[6]。实验中，糖尿病成模大鼠体内出现氧化应激，血清过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶水平明显降低，血清总胆固醇和甘油三酯水平明显升高，而灵芝多糖对大鼠的脂代谢紊乱有明显的改善作用。根据损伤反应学说，动脉粥样硬化首先由高血脂使动脉的内膜受到损伤引起，动脉粥样硬化的发生，与血清TC、TG水平有关，同时氧化应激的发生和发展与血清中TC、TG水平有关[7]。本实验中，高剂量灵芝多糖能显著降低大鼠血清中TC、TG水平，影像形态学显示，灵芝多糖对糖尿病大鼠胸主动脉的内膜有一定的保护作用。

本研究结果提示，灵芝多糖对预防糖尿病体内氧化应激的发生、发展及动脉粥样硬化的发生有一定效果，说明灵芝多糖可以作为糖尿病的辅助治疗手段。

参考文献

[1] MaritimAC,Sanders RA,Watkins JB.Diabetes,oxidative stress,and antioxidants:A review[J].J BiochemMol Tocicol,2003,17(1):24-38.

[2] Newsholme P,Haber EP,Hirabara SM,et al.Diabetes associated cell stress and dysfunction:role of mitoehondrial and nod-mitochondrial ROS production and activity[J].J Physiol,2007,583(1):29-33.

[3] Sakata N,Imanaga Y,Meng J,et al.Increased advanced glycation end products in atherosclerotic lesions of patients with end-stage renal disease[J].Atherosclerosis,2004,142(5):67-77.

[4] 乔进，薛华，孟国梁，等.灵芝多糖对2型糖尿病大鼠胸主动脉内皮功能的保护作用[J].中国动脉硬化杂志，2009，17（9）：709-13.

[5] Lewis A,Steadman R,Manley P,et al.Diabetic nephropathy,inflammation,hyaluronan and interstitial fibrosis[J].Histol Histopathol,2008,23(6):731-9.

[6] Johansen JS,Harris AK,Rychly DJ,et al.Oxidatives tress and the use of antioxidants in diabetes:Linking basic science to clinical practice[J].Cardiovasc Diabetes,2005,4(1):5.

[7] Tomkin GH.Hyperglycaemia:the relation to dyslipidaemia and atherosclerosis[J].Ir Med Sci,2002,171(3):161-4.

中图分类号R965.1

文献标志码A

文章编号1673-7806（2014）05-409-03

作者简介冯艳，女，主管药师E-mail:894453062@qq.com

*通讯作者乔进，男，硕士，主管药师E-mail:felix_jo@163.com

收稿日期2014-05-07修回日期2014-07-04

Effect of Ganoderma Lucidum Polyccharide on Aorta Pectoralis Oxidative Stress

FENG Yan1,QIAO Jin1*,CHEN Hui2,ZHEN Hui-hua2
1Department of Pharmacy,the Third People's Hospital of Nantong 226001,China;2Jiangsu Anhui Biological Technology Co.Ltd,Nantong 226006,China

ABSTRACTObjective：To investigate the protective effects ofGanoderma lucidumpolysaccharide(GLPs) on the impairment of the aorta pectoralis in the STZ induced diabetes mellitus(DM)rats and to explore the effects of GLPs on the oxidative stress in DMrats.Methods：SD rats were fed with high fat diet for 4 weeks,then injected STZ(30 mg·kg-1)to replicate type 2 diabetic rats.The successful diabetic model rats were randomized into normal control group,diabetes group,Ganoderma lucidumpolysaccharides of low and high-dose groups.After 12 week's treatment,the activity of catalase(CAT)and glutathione peroxidase (GSH-PX),the levels of total cholesterol(TC)and triglycerides(TG)in serumwere detected.Slice of aorta pectoralis were stained with HE to observe ultramicro structure and patho-change of aorta pectoralis.Results：The blood glucose concentration of the GLPs-H group was lower than that of the diabetes group(P＜0.01);the activities of catalase and glutathione peroxidase in serumwere significantly higher in the GLPs-H group than in the diabetes group(P＜0.01);The levels of TC and TG in serumwere significantly lower in the GLPs-H group than in the diabetes group(P＜0.01).When observed under light microscope for HE stains,compared with the DMgroup with aortic tunica intima incrassation,injury of endodermis and tunica media incrassation,the GLPs-H group showed less damages.Conclusion：There is a confirmed action of GLPs in depressing oxidative stress and lipid peroxidation of the diabetes rats,and GLPs play a role in the prevention of diabetic complications of aorta pectoralis.

KEY WORDSGanoderma lucidumpolysaccharides;Diabetes mellitus;Oxidative stress