汉桃叶总黄酮的提取及其镇痛抗炎活性研究

黄 婧 ,马健雄

（1.广西壮族自治区桂林市第二人民医院药剂科,广西 桂林 541001； 2.广西医科大学,广西 南宁 530021；3.广西金海堂药业有限责任公司新药研发中心,广西 南宁 530313）

汉桃叶,又名七加皮,为五加科植物广西鹅掌藤 Schefflera arboricola Hayata的干燥茎枝或带叶茎枝,性味微苦、温,为广西特色药材,具有祛风活络、消肿止痛等功效[1]。在壮族医药中,常用于治疗类风湿关节炎等疾病。汉桃叶有镇痛、抗炎、抗菌等作用[2],但其镇痛抗炎活性物质并未明确。为此,笔者系统研究了汉桃叶黄酮类化合物的提取工艺,并对其镇痛、抗炎作用进行了测试,为汉桃叶的深度开发提供参考。

1 仪器与材料

旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；TV-1810型紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）；电热恒温水浴锅（北京医疗设备厂有限责任公司）；EL204型电子分析天平（梅特勒-托利多仪器上海有限公司）。汉桃叶采自广西南宁市郊,并经广西中医药研究院刘步鸣教授鉴定为正品；芦丁对照品（中国药品生物制品检定所,批号为0770-200804）；二甲苯（北京长海化工厂,批号为20080530）；醋酸（天津市泰兴化工有限公司,批号为20091203）；延胡索乙素（中国药品生物制品检定所,批号为110726-200409）；地塞米松（长春长红制药厂,批号为20100419）；伊文思蓝（国药集团化学试剂有限公司,批号为20090913）；其他试剂均为分析纯。昆明种小鼠,由广西医科大学实验动物中心提供,SPF级,证书号为SCXK桂2009-0002。

2 方法与结果

2.1 总黄酮含量测定

方法选择:采用分光光度法,以芦丁为对照品测定汉桃叶醇提物总黄酮含量。

标准曲线绘制:参照文献[3],采用分光光度法,以芦丁为对照品测定并绘制质量浓度（C）对吸光度（A）的标准曲线,测定值经最小二乘法进行线性回归,分析得芦丁对照品的回归方程为A= 1.0527C ＋ 0.0059（r= 0.9999）。

样品测定:称取汉桃叶粗粉适量,按正交试验设计得到的最佳工艺条件进行提取,过滤后滤液转至100mL容量瓶,加乙醇定容至100 mL,即得待测样品溶液。精确吸取该溶液2mL,稀释至10mL,再吸取5 mL置试管中,参照文献[3]的方法,以空白试剂作对照,于510 nm波长处测定吸光度,根据芦丁标准曲线,计算样品中总黄酮含量。

2.2 黄酮提取工艺优化(正交试验)

通过预试验得知,影响汉桃叶黄酮类物质含量提取效果的主要因素有乙醇浓度（因素A）、提取时间（因素B）、提取次数（因素C）和固液比（D）,故以汉桃叶总黄酮含量为评价指标,按照 L9（34）进行正交试验设计,因素水平见表1。

表1 L9(34)正交试验因素水平表

按照表1中的因素水平进行正交设计试验,结果见表2和表3。可见,影响黄酮得率的因素主次为乙醇浓度 ＞提取时间 ＞固液比 ＞提取次数,以极差最小的C因素作为误差项进行方差分析,表明A因素有显著性差异,故提取的最佳条件为 A2B3C2D2。在此条件下,经平行检验5次,得黄酮平均提取率为20.09mg/g,进一步验证了正交试验结果的准确性。

表2 黄硐提取工艺 L9(34)正交试验结果

表3 方差结果分析表

2.3 活性测试试验[4-5]

药液制备:用正交设计试验得出的最佳工艺对汉桃叶药材进行提取,得总黄酮浸膏加适量蒸馏水制成浓度为0.2 g/mL的药液,备用。

镇痛试验:取小鼠50只,雌雄各半,称重标记后随机分为生理盐水组（NS,A组）、延胡索乙素组(B组)和汉桃叶高、中、低剂量组(C1,C2,C3组),每组 10 只,灌胃给药,每日 1 次,连续给药 7 d。末次给药30min后,向各鼠腹腔注射0.6%醋酸溶液0.2mL（用前配制）。观察并记录注射醋酸溶液后20 min内出现扭体反应次数及时间以评价药物的镇痛作用。结果见表4,B组和C1组与A组比较有显著性差异（P＜0.01）,C1组镇痛效果与B组相当。

表4 汉桃叶黄酮镇痛试验结果（±s,n=10）

表4 汉桃叶黄酮镇痛试验结果（±s,n=10）

P 抑制率（%）组别A组B组C 1组C 2组C 3组给药量20 mL/k g 50 m g/k g 50 g/k g 30 g/k g 10 g/k g扭体次数27.5±2.36.9±2.77.6±2.79.2±2.112.8±2.174.9172.3666.5453.45＜0.01＜0.01＜0.05

二甲苯致小鼠耳肿胀试验:取昆明种小鼠50只,雌雄各半,随机分为空白对照组(A组),地塞米松组(B组),汉桃叶高、中、低剂量组(C1,C2,C3组),每组 10只。每只小鼠灌胃给药每日 1次,连续给药7 d,于末次给药时,分别将每只小鼠左耳外侧均匀涂抹二甲苯0.05mL,右耳不涂二甲苯,4 h后脱颈处死,用直径8mm的打孔器在同一部位取下耳片,称取质量,用左右耳片质量差值来表示肿胀程度。试验结果见表5。与A组相比,C1组小鼠耳廓肿胀程度显著降低（P＜0.05）,C3组也有一定的降低；在较高剂量时,汉桃叶黄酮与地塞米松抗炎作用相当。

表5 汉桃叶黄酮对二甲苯致小鼠耳廓肿胀试验结果(±s,n=10)

表5 汉桃叶黄酮对二甲苯致小鼠耳廓肿胀试验结果(±s,n=10)

组别A组B组C 1组C 2组C 3组给药量抑制率（%）P 20 m g/k g 50 g/k g 30 g/k g 10 g/k g肿胀度（m g/g）19.16±1.337.56±3.178.29±1.1810.04±1.1312.12±2.1860.5456.7347.6036.74＜0.05＜0.05

3 讨论

本研究结果显示,汉桃叶黄酮类物质最佳提取工艺为药材粗粉加8倍量80%乙醇回流提取2次,每次1.5 h。本研究中所制备的黄酮在试验浓度范围内有较强的镇痛、抗炎作用,提示汉桃叶黄酮类物质可能为该药材镇痛、抗炎的活性物质。本研究结果对于汉桃叶药材在抗风湿、类风湿的新药研发其有重要的参考意义。

参考文献:

[1]广西壮族自治区革命委员会卫生局.广西本草选编（下册）[M].南宁:广西人民出版社,1974:1720.

[2]陈 蕾,朱雾虹,林瑞超.鹅掌柴属植物化学成分及生理活性研究概况[J].中药材,2002,25（5）:363-366.

[3]丁利君,吴振辉.金银花中黄酮类物质最佳提取工艺的研究[J].食品科学,2002,23（2）:62-66.

[4]陈 奇.中药药理实验方法[M].北京:人民卫生出版社,l991:107-108.

[5]秦贻强,李 江,蔡小玲.红鱼眼醇提物镇痛抗炎作用的实验研究[J].中国药房,2011,22（43）:4046-4048.