菌体裂解法检测结核杆菌药物敏感性的研究

赵光来

【摘要】目的采用菌体裂解法来对结核杆菌进行研究，分析其对药物的敏感程度。痰液标本。方法将我院收治的110例肺结核疾病患者作为实验对象，取患者清晨第一口痰液作为痰液标本，首先去除痰液污染，并将去除污染后的标本放置于37摄氏度常温下。然后，将噬菌体放入标本，并放入100μL的强效病毒，充分震荡，静止，混合体积为5毫升的Medium plus。最后，向平板中加入液态琼脂胶，混合均匀后放置于37摄氏度恒温条件下，静止一夜。采用噬菌体法测定结核菌数量。并采用菌体裂解法检测痰液标本中病菌的阴阳性。结果该法对于肺结核的检出概率为64.5%，而传统涂片对于肺结核的检出率则仅为30%上下，可见裂解法对于肺结核的检出率远远高于涂片法。正常情况下，涂阴培阴患者的阳性检出率为21.6%，可以更好的代表检查的真实结果。该法报告的时间为两至三天，远远小于培养痰液标本的时间。结论菌体裂解法可以很好的节约时间，且检测结果准确，是一种很完美，且颇具研究前景的检测方式，该法对于细菌检查及治疗具有鲜明的指导性，同时，具有很高的应用价值，建议医学界广泛推广应用。

【关键词】菌体裂解法；检测；结核杆菌；药物敏感性；研究

自从结核病菌被人类发现以来，人类就一直致力于研究结核病的发病机理，以及寻求一种好的治疗方法，可以彻底根治结核病菌，免除患者的痛苦。随着科技的发展和医疗技术水平的稳步提高，越来越多的方法被人们发现，对于结核病菌的实验诊断来说，传统的诊疗方式不仅耗费时间长，而且诊断结果往往还差强人意。因此，对于结核病菌的检测和治疗，人们一直没有停止寻求新方法的脚步，医疗界需要一个快速且准确的诊断方法来彻底检测结核病菌。分支杆菌噬菌体恰恰迎合了人类的这一需求，其对于分支杆菌具有很强的特异性，常常被作为工具应用于结核杆菌的治疗中。本文运用菌体裂解法检测结核杆菌药物敏感性效果显著，现将实验过程陈列如下：

1资料与方法

1.1一般资料将我院2011年6月至2011年10月间收治的110肺结核患者作为实验对象，取患者清晨第一口痰液作为痰液标本，其中有92例患者从未接受医院治疗，18例患者则正在接受治疗。经过药物敏感实验得到分离菌株110株，这其中有敏感菌株37株，对异烟肼耐药性较好的为36株，对利福平耐药性较好的为37株。

1.2实验试剂将（法国维达莱勃公司）生产的TB-CHECK-1结核杆菌检测试剂盒作为本次实验试剂。

1.3试验方法①使用N-乙酰-L-半胱氨酸-NaOH法去除2毫升的痰液标本所受的污染，并用15毫升的PhageTek MB Medi Plus溶液洗涤，并将处理过的痰液标本放置于37℃的恒温环境中，搁置时间长度为一夜。②感染噬菌体的操作：将质量为100μL的噬菌体加入痰液标本里，在37℃的恒温条件下放置一小时。③消灭结核外部分散的噬菌体：将质量为100μL的强效病毒加入痰液标本里面，晃荡均匀，并将其放置5分钟。④将体积为5毫升的Medium plus与痰液标本混合，并放置一段时间。⑤将体积为1毫升的帮助细胞放入痰液标本中，并将混合液放置于培养器皿中，向器皿中放入体积为5毫升的液态琼脂胶，快速将容器转动，使二者混合均匀。将其放置于37℃的恒温环境中，静止一夜。

1.4判定标准①若在培养器皿中发现有0至20个菌斑，则说明结果呈阳性，代表痰液标本中结核杆菌已经全部死亡。②若在培养器皿中发现有21个或大于21个菌斑，则说明结果呈阴性，代表痰液标本中有未死的结核杆菌。

2结果

2.1将20例结核分枝杆菌放置于100、500、1000、10000、100000cFu/ml浓度的环境中，并运用噬菌体法来对结核菌的数量进行测定，测定结果见表1。

3讨论

结核病细菌学检查一直以来都是国内外医学关注的焦点。在国外，医疗技术水平较国内水平略高，对于结核杆菌药物敏感性的研究也就更为深入。目前，国外以分枝杆菌噬菌体为研究基础的细菌学主要有以下几个分类，结核杆菌分子生物学，结核病耐药性的检测，治疗结核疾病新药的研发及筛选等，其中对于结核杆菌药物敏感性的研究最为热烈。

本次试验研究主要使用菌体裂解法进行实验，其原理主要是裂解性噬菌体在宿主体内进行繁殖时，会裂解四周宿主，从而留下噬菌斑，因為噬菌斑的数量和未死的宿主菌数量成正比，因此可以以此为依据对结核菌进行培养和实验其对于药物的敏感程度。经过噬菌体裂解法检验可知，结核杆菌有很好的敏感性，当菌液的浓度为102cfu/ml时，即可进行实验。该法对于肺结核的检出概率为64.5%，而传统涂片对于肺结核的检出率则仅为30%上下，可见裂解法对于肺结核的检出率远远高于涂片法。正常情况下，涂阴培阴患者的阳性检出率为21.6%，可以更好的代表检查的真实结果。该法报告的时间为两至三天，远远小于培养痰液标本的时间。根据以上种种情况，可以判定菌体裂解法可以很好的节约时间，且检测结果准确，是一种很完美，且颇具研究前景的检测方式，该法对于细菌检查及治疗具有鲜明的指导性，同时，具有很高的应用价值，建议医学界广泛推广应用。

本次研究中有4例患者的涂阳培阳检测显示结果为阴性，调查发现，该两例病患均为在我院接受一个月治疗后的肺结核患者，之所以菌体数减轻，分析可能是经过短暂治疗后，致病菌的活力减退。本次试验，笔者总结出一些值得注意之处，总结如下：①菌体裂解法检测的阳性菌种有以下几种：结核分枝杆菌，牛分支杆菌，非洲分支杆菌。三种菌种在检测时显示均未死亡。②在进行实验时，要严格按照相关规定进行，设立阴、阳两性进行对比，且在操作时严格注意进行无菌操作你，严禁菌体遭受外界污染。③在对痰液标本进行处理时，方法要规范，尤其要注意彻底混合杀毒试剂。④在向平板中添加琼脂时，要严格控制琼脂温度，最好将其控制在50摄氏度到60摄氏度之间，以免伤害噬菌体。

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