基于AFM的人参水提物对VERO细胞氧化损伤作用研究

刘畅 曲英敏 李景梅

摘要[目的]研究人参水提物对VERO细胞在体外培养中的氧化损伤。[方法]采用细胞体外培养技术、MTT比色法、SOD和MDA试剂盒法、原子力显微镜（AFM）观察法，研究人参水提物对VERO细胞氧化损伤的机制。[结果]人参水提物对VERO细胞能够起到明显的增殖抑制作用。人参水提物对VERO细胞具有一定的的氧化损伤作用且有一定的剂量及时间依赖性。原子力显微扫描成像结果表明正常生长的VERO细胞表面光滑、细胞体积饱满，而人参水提物处理组细胞膜损坏现象明显，细胞表面的粗糙度较大。[结论]人参水提物对VERO细胞具有一定的氧化损伤作用，其作用机制可能与细胞膜的损伤有关。

关键词人参水提物；VERO细胞；原子力显微成像；氧化损伤

中图分类号TQ028.0文献标识码A文章编号0517-6611（2014）01-00113-04

基金项目吉林省科技厅项目（201215136）。

作者简介刘畅（1987-），女，吉林长春人，硕士研究生，研究方向：生物材料，Email：165652403@qq.com。*通讯作者，教授，博士，硕士生导师，从事生物材料研究，Email：ljm3023@126.com。

收稿日期20131210人参是我国的一种传统中药[1]，但关于其毒性的报道较少。研究表明，人参水溶性蛋白对VERO细胞的体外增殖具有一定的抑制作用[2]。VERO细胞来源于非洲绿猴肾，具有无限增殖的特点，常用于药物对肾脏毒性影响的试验[3]。唐蕊华等[4]通过原子力显微镜（AFM）对细胞表面扫描成像手段观察Vero-E6细胞在被汉坦病毒感染前后细胞表面形貌的变化，结果表明使用AFM扫描经不同稀释度的汉坦病毒处理的细胞表面，发现细胞表面粗糙程度、细胞表面的空洞数量均发生一定的改变，采用AFM技术可以通过观察细胞表面超微结构的变化粗略判断出病毒感染细胞的动态过程。笔者采用传统的中药煎煮法制备人参水提物，以非洲绿猴肾细胞作为人参水提物的受试细胞，探讨人参水提物对肾细胞的毒性。

1材料与方法

1.1材料与仪器 1640培养基（Gibco公司）、胎牛血清（FBS，杭州四季青公司）、胰酶（Trypsin，长春天佳公司）；噻唑兰（MTT，Sigma公司）、二甲基亚砜（DMSO，Sigma公司）、鲜人参（购于吉林农业大学，产地为吉林省抚松地区）、SOD试剂盒（南京建成生物工程研究所）、MDA试剂盒（南京建成生物工程研究所）、CO2培养箱（日本三洋公司）、原子力显微镜（N9410S，Agilent）。

1.2提取物的制备取鲜人参根50 g，剪碎，加入700 ml蒸馏水，100 ℃条件下提取4 h，纱布过滤。滤渣重复提取2次，每次4 h。将3次所得滤液合并，60 ℃水浴浓缩至50 ml，离心（4 500 r/min，15 min），弃去沉淀。得到的上清即为人参水提物（WEG）。将WEG置于60 ℃水浴继续浓缩，冷冻干燥后用少量无菌培养液将其溶解，原始浓度为200 mg/ml，用0.22 μm滤膜过滤除菌。用培养液稀释成所需要的浓度。

1.3体外试验方法

1.3.1细胞培养及传代。将VERO细胞用含10%灭活胎牛血清的RPMI1640完全培养液按照1×105个/ml的浓度接种于无菌培养瓶内，置于37 ℃、饱和湿度、5%CO2的培养箱内。0.25%胰酶消化液消化传代，3～4 d传代1次。试验所用VERO细胞均处于对数生长期。

1.3.2MTT法检测WEG对VERO细胞的影响。 将VERO细胞用含8%灭活胎牛血清、1%双抗的RPMI1640完全培养液按照1×105个/ml的浓度接种于培养瓶内，置于37 ℃、饱和湿度、5%CO2（95%空气）培养箱内。0.25%胰酶消化传代，3～4 d传代1次。试验所用VERO细胞均处于对数生长期。

采用MTT比色法检测人参水提物（WEG）对VERO细胞的增殖抑制作用。收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度至105个/ml，取若干块无菌96孔细胞培养板，使每孔加入100 μl含有上述悬浮细胞的培养液，静置，移至培养箱内培养24 h后，弃去原培养液。加入不同浓度的人参提取液，用培养液补足至200 μl，使每孔中药物的终浓度为20、40、60、80、100 mg/ml，对照组加入空白培养液。每组设6个复孔。将培养板置于37 ℃、饱和湿度、5%CO2（95%空气）培养箱中培养3 d后，每12 h取出一块培养板，每孔加入20 μl MTT溶液，继续培养4 h。终止培养，小心吸去孔内培养液。每孔加入150 μl DMSO，置于摇床上低速振荡10 min，使结晶物充分溶解。每组试验重复3次。在酶标仪上以空白孔为对照调零，在波长490 nm处测定各孔的吸光度值，计算细胞增殖抑制率，计算IC50值，以时间、浓度为横轴，以光吸收值（A）、增殖抑制率为纵轴，绘制相应曲线。

抑制率=（1-A490加提取液组细胞吸光值/A490对照组细胞吸光值）×100%

1.3.3WEG对VERO细胞氧化损伤的影响。按照SOD试剂盒、MDA试剂盒说明书中的方法，对不同浓度WEG处理24 h的VERO进行SOD活性、MDA含量的检测。每组试验重复3次。

1.3.4VERO细胞的AFM探测。将经75%乙醇溶液浸泡消毒的盖玻片置于无菌6孔板细胞培养板中，接种对数生长期的VERO细胞，调节细胞密度105～106个/ml，每孔2 ml。培养24 h，吸出培养基并加入WEG，使每孔药物的终浓度为20、40、60、80、100 mg/ml，对照组加入空白培养液。培养48 h后，弃掉培养基，加入无菌PBS轻轻冲洗每孔。弃掉PBS，每孔加入2.5%戊二醛固定细胞15 min。弃掉戊二醛，用超纯水洗涤盖玻片3次。将制备好的样品置于原子力显微镜的XY扫描台上，用监视器定位所要扫描的样品区域，轻敲模式成像。试验采用100 μm扫描器，标准硅探针，微悬臂的弹性系数为40 N/m，共振频率为300 kHz，获得图像像素为512×512。AFM图像以自带软件Pico Image Basic 6.2处理。每组试验重复3次。

1.4数据统计与分析所有数据采用SPSS 19.0软件进行统计分析，组间数据采用独立样本t检验法进行两两比较分析，数据均以±s表示，P<0.05表示差异显著。MTT中的抑制率曲线采用Origin 8.0软件进行分析处理。

2结果与分析

2.1不同浓度人参水提物对VERO细胞体外增殖的影响不同浓度的人参水提物（WEG）均对VERO细胞起到不同程度的增殖抑制作用。从图1可以看出，随着WEG浓度的增加，试验组VERO细胞存活数量明显降低。

2.4WEG对VERO细胞氧化损伤的影响由表1可知，与对照组相比，各浓度WEG组的SOD活性呈明显低于对照组，各组MDA含量明显高于对照组（P<0.05）。随着WEG浓度的升高，各组SOD活性相应降低，各组MDA含量对应性升高。这说明人参水提物对VERO细胞的正常生长起到了破坏作用，使细胞受到损伤。

2.5原子力显微镜对VERO细胞的观测结果基于原子力显微镜在纳米尺度上的观测技术对VERO细胞进行细胞结构上的探测，希望能够从WEG对VERO细胞结构上的影响来探讨WEG对VERO细胞体外增殖的抑制作用。取经20、40、60、80和100 mg/ml WEG培养2 d的VERO细胞，每组至少用AFM扫描成像10个细胞，获得扫描范围为80 μm×80 μm的VERO细胞及表面超微结构图（图4）。

3讨论

中草药被认为毒副作用小、使用安全，但仍有许多因用药不当而引发不良反应的报道[5]。人参的主要活性成分是人参皂苷和人参多糖，其中关于人参皂苷的研究主要集中于改善机体免疫力、对心脑血管的保护作用、抗肿瘤作用等[6]，且研究大多局限于动物试验，其应用于临床实践的药理作用仍需大量研究。据报道，当将一定浓度的人参提取物添加到新生大鼠心肌培养基中时，新生大鼠心肌细胞出现跳动异常的现象，其浓度经连续稀释以后，心肌细胞跳动异常情况随之消失，但当将相同浓度的人参提取物添加到成年大鼠的心肌细胞的培养基中时，心肌细胞未见异常[7]。这说明人参提取物对新生大鼠的心肌细胞具有一定的毒性。

细胞的形貌、结构与细胞的生理状态和功能有着重要的联系，AFM对细胞表面形貌学研究与临床研究的关系越来越密切，并具有着广阔的应用前景[8]。笔者通过AFM对WEG作用的VERO细胞前后形貌、超微结构的对比，从纳米尺度上直观观察WEG对VERO细胞形貌、结构的变化，通过对结构的观察探索WEG对VERO细胞增殖抑制的机理。WEG能明显抑制VERO细胞的体外增殖，并对VERO细胞具有一定的氧化损伤作用，通过原子力显微镜探测技术的引入，经扫描成像发现WEG对VERO细胞的细胞膜具有一定的破坏作用。据此推断，WEG对可能对人体的肾脏具有一定的损伤作用，随着WEG浓度的降低，对肾脏的损伤作用有所减轻，其可能的作用机制有待进一步研究。

参考文献

[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典（2010版）[S].北京：中国医药科技出版社，2010：8.

[2] 李红艳，赵雨，张巍，等.人参水溶性蛋白对几种细胞增殖的影响[J].吉林农业大学学报，2008，30（5）：705-707.

[3] SHIMIZU B，SENO K，KOYAMA H，et al.Manual of selected cultured cell lines for bioscience and biotechnology（in Japanese）[J].Tokyo：Kyoritsu Shuppan，1996，18（2）：299-300.

[4] 唐蕊华，薛小平，尹焕才，等.用原子力显微镜观察汉坦病毒感染前后VeroE6细胞的形貌变化[J].中国实验诊断学，2008，12（5）：598-601.

[5] 李庆虹，山丽梅，任永申.中药毒性研究进展[J].中华中医药杂志，2007，22（5）：300-302

[6] JONG D P，DONG K R，YOU H L.Biological activities and chemistry of saponins fron Panax ginseng C.A.Meyer[J].Phytochemistry Reviews，2005，4：159-175.