一株A型副鸡嗜血杆菌的分离鉴定

李峰　苗立中　沈志强

摘 要：从山东省某蛋鸡场发病鸡群中分离到一株细菌，经培养特性观察、生化试验、V因子生长试验、致病性试验和PCR试验，证实分离菌为一株致病性副鸡嗜血杆菌，血清型鉴定该菌为A型。药物敏感性试验表明分离菌对头孢噻肟、头孢曲松、丁胺卡那霉素高度敏感，对硫酸新霉素、强力霉素中度敏感，对磺胺间甲氧嘧啶钠、环丙沙星、庆大霉素耐药。

关键词：A型；副鸡嗜血杆菌；传染性鼻炎；分离鉴定近日，山东某养殖场一批140日龄左右的鸡群出现面部单侧或双侧肿胀，流鼻涕、打喷嚏症状，并且2d内产蛋率下降约10个百分点，场主即携带发病鸡到我院兽医诊断中心就诊。经病原分离、生化试验、V因子生长试验、致病性试验和PCR鉴定，确诊为A型副鸡嗜血杆菌感染，经药敏试验，选择敏感药物治疗，较快控制了疫情。现将试验情况报告如下。

1 材料

1.1 病料 3只发病鸡，山东某养殖场提供。

1.2 试验鸡 10只30日龄非免疫健康鸡，由山东绿都生物科技有限公司实验动物中心提供。

1.3 培养基 鸡鲜血琼脂、鸡血清肉汤琼脂、麦康凯琼脂培养基，按文献方法[1]自制。

1.4 标准副鸡嗜血杆菌阳性血清 山东省滨州兽医生物技术重点实验室提供。

1.5 细菌微量生化反应管 购于杭州天和微生物试剂有限公司。

1.6 药敏试验纸片 购自北京天坛药物技术开发公司。

1.7 PCR扩增引物 参照GenBank中副鸡嗜血杆菌的基因序列，借助Primer5.0引物设计软件设计1对引物。

A上游5-GCGGGACACGATGTGGCTAT-3，B下游5-TGGCGATGACGTTCCTCAAT-3，由上海生工合成。

2 方法

2.1 细菌分离培养 将病鸡处死，用棉拭子沾取眶下窦内容物，分别划线接种于鸡鲜血琼脂、鸡血清肉汤琼脂、麦康凯琼脂培养基上，置5%的CO2培养箱，37℃培养16～24h后观察，挑取单个可疑菌落接种到含血清的鸡肉汤培养基中进行纯培养，同时涂片，革兰氏染色、镜检。

2.2 生化鉴定 将纯化好的细菌划线培养后，取单个菌落接种于生化反应管内，并在微量发酵管中分别加入0.2ml的鸡血清和浓度为1%的辅酶I 0.2ml，用蜡封口，倒置于放有脱脂棉的平皿内，37℃厌氧罐中培养24～48h，观察结果。

2.3 V因子生长试验 用接种环蘸取新鲜的肉汤培养物，在无NAD的鸡血清肉汤琼脂上划8～10条横线，再用金黄色葡萄球菌划一竖线，翻转平板置37℃，5%CO2培养箱培养18～20h，观察分离物是否出现卫星现象。

2.4 致病性试验 将纯培养的菌落接种于鸡血清肉汤中培养24h，接种30日龄龄非免疫健康小公鸡6只，每只鸡各取0.2ml培养物进行眶下窦接种，同时滴鼻（1×108CFU/ml）；同时用生理盐水接种4只试验鸡，0.2ml/只，作为对照组。分别隔离饲养观察。对出现典型症状的鸡，无菌采取眶下窦分泌物，进行本菌的回收培养。

2.5 PCR鉴定 以分离菌鸡血清鸡肉汤纯培养物2m作为模板进行PCR鉴定。采用25反应体系（超纯水17μl、10×PCR buffer 2.5μl、dNTP 2.0μl、A和B各1μl、模板1μl、rTap酶0.5μl）于95℃变性5min，25个循环（94℃1min，53.9℃1min，72℃2min）最后72℃延伸10min。1%的琼脂糖凝胶电泳，观察结果。

2.6 血清型鉴定 用常规凝集试验方法，取纯化菌株与A、B、C型副鸡嗜血杆菌的标准阳性血清进行凝集试验。

2.7 药敏试验 用纸片法进行，对分离菌用头孢噻肟、头孢曲松、丁胺卡那霉素、硫酸新霉素、强力霉素、磺胺间甲氧嘧啶钠、环丙沙星、庆大霉素共八种药物在鸡肉汤琼脂平板上，按常规纸片法进行了药敏试验。

3 结果

3.1 细菌分离鉴定结果 无菌接种培养基24h后，在麦康凯琼脂、鲜血琼脂平板上，均无菌生长。在鸡血清肉汤琼脂上长出灰白色露滴状、边缘整齐、表面光滑、有轻度隆起、粘液状、湿润、有光泽、不透明、边缘有虹彩的菌落。挑取菌落涂片，染色、镜检，为革兰氏阴性球杆菌，单个、成对或多个堆积在一块。

3.2 生化试验结果 分离菌能够发酵葡萄糖、木糖、麦芽糖、蔗糖、甘露糖，不发酵乳糖、菊糖、鼠李糖、山梨醇、和肌醇，过氧化氢酶反应阴性，硫化氢试验阴性，吲哚试验阴性，硝酸盐还原试验阳性。

3.3 V-因子需求试验结果 培养24h后观察，在靠近金黄色葡萄球菌划线处，该菌菌落生长密集，比较大，成半透明状，远离金黄色葡萄球菌处的菌落则生长稀少，也比较小，呈较典型的“卫星现象”。

3.4 致病性试验结果 试验鸡接种后5d开始出现发病症状，到第7天流鼻液，不同程度的单侧脸部和眼睑肿胀，个别鸡有呼吸困难。对照组鸡正常。从人工感染发病鸡的眶下窦的分泌物中均能分离到本菌。

3.5 PCR鉴定 分离菌DNA的提取由BioTeke基因组DNA提取试剂盒提取（按照试剂盒说明书提取），以DNA基因组为模板PCR扩增，获得了939bp的目的阳性条带（如图1）。

3.6 血清型鉴定结果 分离菌能够与A型鸡副嗜血杆菌的标准阳性血清在3～5min内出现凝集现象，且与B、C型鸡副嗜血杆菌的标准阳性血清无凝集发生。同时阳性对照和阴性对照均成立。

3.7 药敏试验结果 分离菌对头孢噻肟、头孢曲松、丁胺卡那霉素高度敏感，对硫酸新霉素、强力霉素中度敏感，对磺胺间甲氧嘧啶钠、环丙沙星、庆大霉素耐药。

4 小结与讨论

4.1 根据临床症状、细菌分离培养、生化试验、V因子生长试验、致病性试验和PCR试验及血清型鉴定，证明病原为A型副鸡嗜血杆菌。通过药敏试验，选择丁胺卡那霉素用于该场治疗，在短时间内有效控制了疫情。

4.2 副鸡嗜血杆菌主要导致传染性鼻炎临床症状主要特征为流鼻涕、打喷嚏、单侧或双侧眼睑水肿，并能导致产蛋鸡产蛋量下降10%～40%不等，若与其他病毒性疾病并发，死亡率具增高趋势[2]。

4.3 副鸡嗜血杆菌的培养需要V因子，由于葡萄球菌具有产生V因子的特性。所以常利用与葡萄球菌同培养的方式，以是否产生“卫星现象”作为该菌鉴定的重要依据[3]。本试验符合这一特性。

4.4 按Page的分型方法，副鸡嗜血杆菌可分为A、B和C三个血清型，我国于1987年首次在北京分离到副鸡嗜血杆菌[4]，目前A、B和C三个血清型已均有报道[5-7]。而目前我国批准使用疫苗多为A、C型二价疫苗，所以常见病例多是由于未正常免疫或者是由于新的血清型的出现导致免疫失败引起的。因此，研制开发新的含三种血清型的疫苗是提高防控本病的有效手段。

参考文献：

[1] 陈天寿.微生物培养基的制造与应用[M].第一版.北京：中国农业出版社.1995，239-240.

[2] B.W卡尔尼克.禽病学[M].第十版.北京：中国农业出版社.1999，218-234.

[3] 刁有祥. 禽病学.北京：中国农业科学技术出版社.2008，217-223.

[4] 冯文达.北京及传染性鼻炎病原菌的分离鉴定[J].微生物学通报，1987，（5）：216～219.

[5] 苗得园，孙惠玲，陈晓峰，等.副鸡嗜血杆菌的分离鉴定及我国鸡传染性鼻炎的流行状况分析[J]. 中国预防兽医学报，2006，28（4）：392-395.

[6] 张培君，苗得园，龚玉梅，等.B型鸡副嗜血杆菌的分离鉴定[J].中国预防兽医学报，2003，25（1）：56～58.

[7] 苗立中，沈志强，王艳，等.副鸡禽杆菌河南株的分离及PCR鉴定[J].畜牧与兽医，2010，2：66-68.