兰属品种间遗传多样性的AFLP分析

王晓英 王长宪

摘 要：为从分子水平上研究兰属植物的遗传多样性和建立适合的分子标记反应体系。本研究采用AFLP分子标记技术，对兰属植物的9个品种进行了遗传多样性分析。结果表明，筛选得到的8对引物共扩增出965条DNA片段，其中多态性条带为931条，平均1对引物扩增条带121条（多态性带116条），多态性位点频率为95.87%，说明遗传多样性丰富。用NTSYS2·10进行UPGMA聚类分析，属于同种的品种聚在一起，与表型分类基本吻合。兰属植物间遗传相似系数变化范围为0.416～0.606。此分子标记技术体系可为兰属分类及种质遗传多样性分析提供技术依据。

关键词：兰属；品种；AFLP；遗传多样性

中图分类号：S682.31 文献标志码：A 论文编号：2014-0113

Abstract： The aim was to analyze genetic diversity of Cybidium and establish suitable reaction system from the molecular level. The genetic diversity and relationship of 9 cultivars of Cymbidium were evaluated using AFLP molecular markers in this study. Among the 965 AFLP bands obtained from eight selective primer pairs， 931 （95.87%） were polymorphic. The average number of DNA bands per primer pair was 121，and the average number of DNA polymorphic bands per primer pair was 116. Using NTSYS2·10 to UPGMA cluster analysis， cultivars originated from the same species could be clustered together in the AFLP dendrogram and this division was in consistence with the morphological classification. Genetic similarity among the cultivars ranged from 0.416 to 0.606. The reaction system of AFLP could be used to the classifying of Cybidium and the analysis of its germplasm genetic diversity.

Key words： Cybidium； Cultivar； AFLP； Genetic Diversity

0 引言

兰属（Cymbidium）是兰科的树兰亚科的一个属，全世界约有兰属植物55种，主要分布于亚洲热带与亚热带地区，向南到新几内亚岛和澳大利亚。中国有49种兰属植物和一些变种，产于秦岭以南各省[1]，中国人传统上所说的兰花，大都是指兰科兰属中的地生兰类植物，具有重要的药用价值和观赏价值[2-3]。

传统的兰属植物分类和品种鉴定常常以花和叶的形态特征为依据，结果往往受到生长环境和发育阶段的限制。由于各种变种以及自然杂交种的存在，仅凭植株的形态特征进行兰花种质鉴定较为困难，这对兰花品种研究产生了不利影响。DNA分子标记技术以遗传物质为依据，从基因水平直接反映种间和种内差异，突破以往用传统方法分类鉴定的局限性，直接在物种基因组DNA水平上显示遗传多样性，为分类鉴定提供了高效准确的方法。

AFLP是新发展起来的一项检测DNA多态性技术，它从原理上结合了RFLP和RAPD的优点，具有高分辨率、高重复性、高灵敏度和共显性等特点，通过对基因组DNA的限制性酶切片段进行选择性扩增而揭示多态性[4-5]。AFLP标记技术已经在DNA指纹图谱绘制、品种鉴定、遗传多样性分析及基因定位等方面得到了广泛应用[6]。目前，已用于兰属植物的分子标记技术有RAPD[7-9]、ISSR[10-12]和SRAP[13-14]，利用AFLP分子标记技术对兰属植物遗传多样性研究较少且技术体系存在差异[6，15]，本实验以9个兰属品种为研究材料，利用AFLP技术进行遗传多样性分析，拟建立适合兰属植物的AFLP分子标记反应体系，为兰属植物遗传多样性研究及新种的选育提供分子水平的技术依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

供试材料为兰属（莲瓣兰、建兰、春兰和春剑）的9个品种（表1），由泰安市泰山林业科学研究院兰花种质资源圃提供。

1.2.5 凝胶分析 选择性扩增产物和上样缓冲液比例为8：3，涡旋混匀，95℃变性，8 min后，立即冰浴，取4 μL上样到ABI377测序仪，进行4%聚丙烯酰胺凝胶电泳，室温下电泳2.4 h，自动采集原始胶图。对照（Marker）为ROX500分子量内标。电泳结束后用Genescan3.1从原始胶图中提取数据，然后用Binthere将片段的大小提取出来，再用Excel将数据转换成0和1数据，用Popgene和Ntsys2·10进行多态性和聚类分析。用Max comp程序对聚类结果和相似系数矩阵之间的相关性进行Mantel检验。

2 结果与分析

2.1 引物筛选和多态性分析

通过对64对AFLP引物的筛选，筛选出了8对多态性较强且扩增产物清晰的引物组合（表2）。8对引物共扩增条带965条，其中多态性带931条；平均1对引物扩增条带121条，其中多态性带116条，多态百分比为95.87%。8对引物组合均能揭示DNA多态性，其中引物HindIIIAAC/MseI CTC扩增出多态性条带最少为100条，多态性比例为98.04%，HindIIIAGC/MseI CTC扩增的多态性带最多为132条，多态性比例为97.06%，表明兰属植物具有丰富的遗传多态性。

2.2 凝胶分析

AFLP扩增产物长度介于70～500 bp之间，其中引物HindIIIAGC/MseI CTT的聚丙烯酰胺凝胶电泳结果见图1，结果条带清晰，该引物共扩增出132条带，其中多态性带125条，占94.7%，说明上述体系可用于兰属植物的AFLP分析。

2.3 聚类分析

基于AFLP的扩增结果，用NTSYS2·10进行UPGMA聚类分析，得到兰属植物品种亲缘关系树状图（图2）。将聚类结果进行Mantel检验，相关系数为0.8219，达到极显著水平，表明聚类结果很好地体现了兰属植物品种间的亲缘关系。由AFLP技术得到的聚类图将9个品种共分为4个部分，属于同种的品种聚在一起，与表型分类基本吻合，如春兰品种集圆、万字和宋梅聚在一起，建兰品种地荷、神童冠、小天龙和绿梅也聚在一起。聚类结果表明AFLP技术可将种内的品种完全区分开。总之此技术体系可以很好地揭示供试兰属植物种间和种内的遗传差异和亲缘关系。

9个品种间遗传相似系数变化范围为0.416～0.606。‘小天龙和‘绿梅间相似系数最高，为0.606，说明具较高的同源性。‘荷型素与其他供试品种的遗传相似系数都较小，与‘万字的相似系数最小，为0.416，说明‘荷型素与‘万字间的遗传距离较远。

3 结论与讨论

前人利用AFLP技术对兰属植物进行遗传多样性研究的酶切体系均采用EcoRI/MseI[6，16-17]和PstI/MseI[15]，而本实验条件下，HindIII/MseI体系能够得到清晰、稳定和多态性丰富的指纹图谱，DNA分子水平上的多态性可对兰属植物进行遗传多样性分析，通过聚类分析可区分兰属植物，完善和补充了兰属植物分子标记反应体系，是一种适于兰属亲缘关系及遗传多样性分析的方法。

谢伟等[7]和梁红健等[18]认为莲瓣兰与春兰、建兰是平行关系，而本实验结果表明莲瓣兰品种与春兰品种的亲缘关系较近，这与陈心启等[2]和孙彩云等[19]的研究结果基本相符；本实验结果表明春剑品种和春兰品种亲缘关系较远，与吴应祥[20]观点一致，而陈心启等[2]认为春剑是春兰的一个变种。总之，兰属种间和种内分类存在分歧，有待进一步深入研究，对兰属种质资源保护与新品种开发都有重要意义。

参考文献

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