枯草芽孢杆菌T122F菌剂对香蕉的生物效应研究

甘林 陈汉鑫 杨留水 阮宏椿 杜宜新 石妞妞 陈福如 杨秀娟

摘 要 采用室内与田间试验相结合的方法研究了枯草芽孢杆菌T122F菌剂对香蕉生物效应的影响。结果表明：菌剂能明显促进香蕉生长，主要表现为香蕉株高、假茎周长、叶片数以及叶绿素含量的增加。菌剂的施用还能显著提高香蕉内生细菌数量、叶片耐菌能力和根际土壤细菌数量。在300倍液处理下，从香蕉苗根部分离到的菌量为299.75×103 cfu/g FW，是对照的7.16倍，而从香蕉根际土壤中分离到的菌量则是对照的2.20倍。此外，经菌剂处理的香蕉根际土壤水浸液对香蕉枯萎病菌孢子萌发也表现出明显的抑制作用。

关键词 枯草芽孢杆菌菌剂；香蕉枯萎病；香蕉；生物效应

中图分类号 S852.61 文献标识码 A

香蕉是热带、亚热带地区的重要水果和经济支柱，由古巴尖孢镰刀菌（Fusarium. oxysporum f.sp.cubense）引起的香蕉枯萎病是香蕉生产上一种毁灭性的土传病害。目前，对该病害的防治尚未发现较为理想的杀菌剂和抗病品种，而一些栽培管理措施也只能起到局部控制的效果[1]。生物防治具有安全环保、不杀伤天敌、不危害人畜、有利于生态平衡和稳定等优势，在生产上对土传病害具有较好的防治效果，是目前研究克服土传病害的重要方法之一[2-5]，因此开展香蕉枯萎病的生物防治研究具有重要的意义。

枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）具有显著的抗菌活性和极强的抗逆能力，对人畜无明显毒害[6]。由于该菌在培养发酵过程中能形成抗逆性强的芽孢，因此制成的生防菌剂具有较长的货架期，便于开发成商品。目前，国内已成功开发并投入生产的枯草芽孢杆菌商品制剂对水稻、大豆、棉花等农作物上的重要病害均表现出较好的防治效果[7-8]。而试验结果表明，枯草芽孢杆菌对香蕉枯萎病具有良好的防效。Thangavelu R等[9]从香蕉根围土壤中分离出的枯草芽孢杆菌对香蕉枯萎病菌菌丝生长具有显著的抑制作用，防病效果可达41%。殷晓敏等[10]采用浸根处理的方法发现，枯草芽孢杆菌B215对香蕉枯萎病的盆栽防效为62.95%。牛春艳等[11]对香蕉的叶腋进行喷施生防菌，研究表明枯草芽孢杆菌TR21对香蕉枯萎病的田间防效可达61.92%。但在利用枯草芽孢杆菌菌剂进行香蕉枯萎病的生物防治以及其对香蕉生物效应影响等方面的研究较少。张志红等[12]将腐熟的有机肥与3种生防细菌组合成生物复混肥和生物有机肥，发现对香蕉枯萎病具有较好的防治效果，同时可引起土壤中的真菌数量明显下降，放线菌数量明显升高。

目前，本实验室已筛选出1株对香蕉枯萎病菌具有较强抑制作用的枯草芽孢杆菌T122F，前期的试验发现该菌株能有效地定殖于香蕉体内，研制出的枯草芽孢杆菌菌剂对香蕉枯萎病也表现出较好的防治效果。为了进一步明确该菌剂对香蕉枯萎病的生防机理，本试验测定了T122F菌剂对香蕉生长、根际土壤微生物数量及其抑菌活性等生物效应方面的影响，以期为该菌剂的合理施用以及香蕉枯萎病的生物防治提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与主要仪器

供试香蕉品种为台蕉2号（Musa AAA），由福建省漳州市农业科学研究所生物中心提供；供试香蕉枯萎病生防菌剂为200亿活芽孢/克枯草芽孢杆菌T122F可湿性粉剂、供试病原菌为香蕉枯萎病菌4号生理小种（F. oxysporum f.sp.cubense race 4），均由福建省农业科学院植物保护研究所提供；香蕉枯萎病菌的培养采用马铃薯蔗糖培养基（PSA），香蕉植株体内细菌数量以及根际土壤细菌数量的测定采用牛肉膏蛋白胨培养基（NA）；SPAD-502PLUS便携式叶绿素测定仪由广州沪瑞明仪器有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1 菌剂对香蕉苗生长的影响 将有4片叶的香蕉组培苗种植在直径16 cm的黑色营养袋中，每袋1株。7 d后待香蕉苗恢复长势时，采用灌根法，每株浇灌1 ∶ 300倍液的菌剂50 mL，每隔10 d浇灌1次，共3次，以浇灌清水为对照，每个处理10株，试验设置3次重复。第3次施菌剂后20 d，调查香蕉苗展开的叶片数、测量株高，并采用叶绿素测定仪测量香蕉近基部第2叶的叶绿素含量。

1.2.2 菌剂对香蕉苗内生细菌数量的影响 将有6片叶的香蕉组培苗种植在直径16 cm黑色营养袋的灭菌土壤（121 ℃，2 h）中，每袋1株，每株浇灌1 ∶ 300倍液的菌剂100 mL，以浇灌清水为对照，每个处理15株。菌剂处理后10 d，随机取香蕉苗3株，将香蕉根、球茎、叶分别合并后，参照杨秀娟[13]的方法，进行香蕉苗内生细菌的分离，统计每皿菌落数，计算平均每毫克根、球茎和叶（鲜重）的含菌量。试验设置3次重复。

1.2.3 菌剂对香蕉苗离体叶片耐菌能力的影响

在1.2.1的方法基础上，每个处理30株香蕉苗。菌剂处理后10 d，选择长势相当的香蕉近基部第2叶，用细针在叶片正面上方和下方叶脉左右两侧中间部位进行针刺处理，然后将处理好的叶片移到含1.2%水琼脂培养基的培养皿中保湿，将菌龄一致的香蕉枯萎病菌菌块（d=0.4 cm）贴置于香蕉叶片上方针刺位点和下方针刺位点处，有菌丝的一面朝下。培养皿用封口膜封好，置于28 ℃光照培养箱中（光 ∶ 暗=12 h ∶ 12 h，光强2 000 lx），4 d后采用十字交叉法测量叶片针刺点叶片组织损伤斑直径，取其平均值比较处理间的差异。试验设置3次重复。

1.2.4 菌剂对大田香蕉植株生长及根际土壤细菌数量的影响 选择土壤肥力一致，且前作香蕉枯萎病发病较均匀的蕉园种植香蕉苗，45 d后施菌剂稀释液，每株2 L，之后每隔30 d施菌剂1次，每株2.5 L，共3次。菌剂稀释液设置1 ∶ 100倍、1 ∶ 200倍和1 ∶ 300倍共3种处理，第3次施菌剂后20 d，调查各处理香蕉的长势，测量株高、假茎粗和叶片叶绿素含量。同时在离香蕉基部30 cm处的东、南、西、北4个方位，各取其10 cm深处的根际土壤共约1 000 g，每株香蕉根际土壤在45 ℃下烘24 h后，研磨均匀，过筛，参照王占武[14]的方法测定根际土壤细菌的数量。每个处理共10株香蕉，以浇灌清水为对照，试验设置3次重复。

1.2.5 菌剂对香蕉根际土壤抑菌活性的影响 在1.2.4的方法基础上，将采集的香蕉根际土壤与无菌水按1 ∶ 10混匀后，上清液经无菌双层滤纸过滤后洗下PSA平板上香蕉枯萎病菌的分生孢子，制成孢子浓度为5×106 cfu/mL的悬浮液，在水琼脂平板上将菌液涂匀，每株香蕉根际土壤重复3次，28 ℃恒温培养15 h后，在400倍镜下观察孢子萌发情况，以萌发的芽管长度超过分生孢子短轴长视为萌发，每个处理观察约300个孢子，重复3次。计算孢子萌发率和孢子萌发抑制率。每个处理随机取样5株香蕉的根际土壤，以无菌剂处理的香蕉根际土壤水浸液洗下的分生孢子为对照。

孢子萌发率/%=（萌发的孢子数/孢子总数）×100

孢子萌发抑制率/%=（对照孢子萌发率-处理孢子萌发率）/对照孢子萌发率×100

1.3 数据分析

试验数据采用Excel 2003和DPS 6.85软件进行分析，采用Duncan氏新复极差法分析不同处理间差异显著性。

2 结果与分析

2.1 菌剂对香蕉苗生长的影响

在香蕉苗盆栽试验中，菌剂300倍稀释液处理能明显促进香蕉苗生长，菌液处理的香蕉苗平均叶片数、株高和叶绿素分别为6.60片、18.20 cm和42.10 SPAD，分别比对照增加0.53片、4.27 cm和1.84 SPAD，与对照相比，差异均显著（表1）。

2.2 菌剂对香蕉苗内生细菌数量的影响

与对照相比，菌剂的施用能显著提高香蕉苗根部、球茎部和叶部内生细菌数量，其分离到的菌量分别为299.75×103、45.20×103、28.93×103 cfu/g FW，分别是对照的7.16、2.72、5.56倍（表2），其中以香蕉苗根部分离的内生细菌数量最多，球茎部次之。

2.3 菌剂对香蕉苗离体叶片耐菌能力的影响

菌剂的施用能显著提高香蕉苗离体叶片的耐菌能力，表现为叶片组织损伤斑直径显著小于清水处理的对照（表3），经菌剂处理的香蕉叶片，其上方位点和下方位点的叶片组织损伤斑平均直径分别为0.81 cm和0.74 cm，两者之间差异不显著。而空白对照的香蕉叶片，其上方位点和下方位点处理的叶片组织损伤斑平均直径分别为1.09 cm和0.96 cm，两者之间差异显著。

2.4 菌剂对大田香蕉长势的影响

在大田香蕉生长期间，施用菌剂能明显提高香蕉植株的长势，主要表现为株高、假茎周长和叶片叶绿素含量均明显高于清水对照。其中以菌剂1 ∶ 100倍液处理的效果最好，其株高、假茎周长和叶片叶绿素含量与对照相比，差异均显著（表4）。

2.5 菌剂对大田香蕉根际土壤细菌数量的影响

由表5可知，施用菌剂能明显提高香蕉根际土壤的细菌数量，在菌剂稀释100倍液、200倍液和300倍液的3种浓度中，从香蕉根际土壤分离到的菌量分别为58.08、51.70和49.50（106 cfu/g），分别是对照的2.59倍、2.30倍和2.20倍。差异显著性分析结果发现，在菌剂施用的3种浓度中，其分离到的菌量差异不显著。

2.6 菌剂对大田香蕉根际土壤抑菌活性的影响

菌剂的施用能显著提高香蕉根际土壤的抑菌活性。与对照的土壤浸出液相比，菌剂处理的土壤浸出液能明显抑制香蕉枯萎病菌分生孢子的萌发。其中以菌剂1 ∶ 100倍液处理的土壤浸出液抑制孢子萌发效果最好，菌剂1 ∶ 200倍液处理的土壤浸出液抑制效果次之，但两者间差异不显著（表6）。

3 讨论与结论

枯草芽孢杆菌是一类广泛分布于土壤、植物根际表面以及体内等各种不同生活环境中的革兰氏阳性杆状好养型细菌，不仅能产生多种抗菌素和酶，还能分泌类似植物生长素的代谢物，诱导植物内源生长激素和叶绿素含量的增加，促进植物生长[15]。易有金等[16]采用盆栽试验和内源激素检测等方法，发现施用内生枯草芽孢杆菌B-001后，烟草幼苗的鲜重以及烟草体内的吲哚乙酸、赤霉素和玉米素核苷的含量增加，而脱落酸的含量降低。Fahin等[17]的研究也证实了枯草芽孢杆菌能分泌植物激素，对莴苣叶片生长有促生作用。本试验研究发现，施用枯草芽孢杆菌T122F菌剂后对香蕉生长有显著的促进作用，推测枯草芽孢杆菌产生的类似植物生长素的代谢物和菌剂中的某些营养物质参与了香蕉的生长。

自然界中有很多细菌或真菌在接种进入土壤后能协调与周围微生物的关系，营造不利于土传病原菌生长的环境从而达到抑制植物病害发生的效果，当土壤微生物群落结构越丰富，物种越均匀，多样性越高时，对抗病原菌的综合能力就越强[18-20]。胡菊等[21]于2006年研究发现施用VT生物菌剂后，处理土壤中细菌、酵母菌和放线菌的数量增多，有效减少了病原菌的数量。Zhao等[22]则发现含有功能微生物枯草芽孢杆菌Y-IVI的生物有机肥（BIO）不仅对甜瓜枯萎病有很好的防治效果，且根际土壤中枯草芽孢杆菌Y-IVI的数量显著高于对照。施用生物有机肥后寄主体内抗菌脂肽类物质和依枯草素A的含量也高于其他处理。本试验研究发现施用枯草芽孢杆菌T122F菌剂能显著增加香蕉苗根部、茎部和叶部内生细菌以及大田植株根际土壤细菌的数量，提高香蕉苗离体叶片的抗菌能力和香蕉植株根际土壤的抑菌活性，试验结果与前人报道的结果相符。后期调查发现，大田香蕉植株施菌液后其枯萎病的株发病率减少了70%以上，表明香蕉枯萎病的发生与植株体内、根际土壤中细菌的数量以及土壤的抑菌作用可能存在着密切的关系。此外，枯草芽孢杆菌T122F能有效定殖于香蕉根、茎、叶中，推测香蕉内生细菌种群数量的增加和叶片耐菌能力的提高与菌剂中枯草芽孢杆菌的定殖特性有一定的相关。

综上所述，枯草芽孢杆菌菌剂不仅含有抗逆性强的芽孢，还含有菌体发酵过程中产生的抑菌代谢物及残余的营养物质。菌剂的施用不仅对香蕉本身具有促生作用，而且可增加植株体内内生细菌以及根际土壤细菌的数量，降低病原菌对根系的侵染，有利于土壤的生态系统朝着稳定健康的方向发展。在当前因大量使用化学农药和复合肥防治植物病害造成对环境污染和人类健康危害的同时，利用安全、环境友好的生防菌剂于香蕉生产，对预防香蕉枯萎病的发生、蔓延与危害，保障香蕉种植业的健康发展具有良好的应用前景。

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责任编辑：叶庆亮