离体牙短期应用酪蛋白磷酸多肽钙磷复合体再矿化的实验研究

陈燕等

[摘要]目的：评价短期应用10%酪蛋白磷酸多肽钙磷复合体（complex of casein phosphopeptide and amorphous calcium phosphate，CPP-ACP）（商品名：Tooth Mousse护牙素）离体牙釉质片再矿化的功效。方法：将正畸需要拔出的离体前磨牙15颗从冠根向一分为二，共30个实验样本，用自凝材料包埋于塑料圈内，根据扫描电镜样品的要求打磨抛光，抛光后的牙釉质面积为3mm×3mm。用数字随机表的方法随机分成4个实验组和1个对照组，每组6个。对照组是用37.5%磷酸酸蚀浸泡牙釉质2 min 后不用护牙素浸泡，实验组均用37.5%磷酸酸蚀浸泡牙釉质2min后分别用Tooth Mousse护牙素涂搽牙面30 min，置于蒸馏水中浸泡。每组浸泡的时间逐步累加，A、B、C、D实验组分别浸泡时间为1、5、10、20h 。每组待第2天在同一时间涂搽护牙素及在蒸馏水中浸泡的步骤同第1天 ，每天更换蒸馏水一次。每组连续作用5次。扫描电镜观察及用能谱检测钙的质量分数 ，统计分析各组釉柱再矿化与浸泡时间的关系。结果：A、B、C、D实验组釉质表面钙质量分数是（67.38±0.89、67.63±0.56、67.71±0.52、69.11±0.27）和酸蚀组65.74±0.74之间的差异有统计学意义（F=21.568，P=0.000<0.01）；用（Student-Newman-Keuls）法做多组间样本均数的两两统计比较分析，A、B、C组间差异均无统计学意义（P>0.05）；D实验组与A、B、C组间差异均有统计学意义（P<0.05）。结论：Tooth Mousse护牙素体外实验在蒸馏水环境中多次短时间每天20h浸泡离体牙釉质在减少脱矿和促进再矿化方面较实验其余3组作用显著。

[关键词]酪蛋白磷酸多肽钙磷复合体；釉质；脱矿；再矿化

[中图分类号]R783.5 [文献标识码]A [文章编号]1008-6455（2014）17-1441-04

Calcium and phosphorus teeth from short-term application of the complex of casein phosphopeptide and amorphous calcium phosphate experimental study on remineralization

CHEN Yan，ZHOU Yan，LI Ming-dong，JIANG Rong-Ling，TANG Ji-wei，LU Qi-fang

（Department of Stomatology，The People's Hospital of Guangxi，Nanning 530021Guangxi，China）

Abstract： Objective To evaluate the effect of complex of casein phosphopeptide and amorphous calcium phosphate application in enamel remineralization in vitro. Methods 30 orthodontic were randomly divided into 4 experimental groups and 1 control groups， each group of 6.The control group with 37.5% phosphoric acid etching of enamel after 2 min immersion Without tooth moussesoaking，experimental groups with 37.5% phosphoric acid etching of enamel after soaking 2min respectively with Tooth Mousse tooth Mousse Tucha tooth 30 min， placed indistilled water immersion.A，B，C，D groups were soaking for 1，5，10，20h.Each stay for second days at the same time Tucha tooth mousse and with the first day the steps of immersing in distilled water. Continuous action each 5 times.Electron microscope andenergy spectrum detection by mass fraction of calciumscan， statistical analysis on the relationship between theenamel remineralization and immersion time. Results A，B，C，D in experimental group， the enamel surface calciummass fraction is（67.38±0.89，67.63±0.56，67.71 ±0.52，69.11±0.27） had significant difference and acid etching group 65.74± 0.74 between （F=21.568，P=0.000<0.01）； （Student-Newman-Keuls） compared with two two statistics do group like the mean difference，A，B，C groups were notstatistically significant （P>0.05）； experimental group D and A，B，C between group differences were statistically significant （P<0.05）. Conclusion Tooth Mousse tooth mousse in vitro experiments in distilled water environmentin a short time 20h day soaking in reducing enameldemineralization and remineralization than the other 3 groups significantly effect experiment.

Key words：complex of casein phosphopeptide and amorphous calcium phosphate；enamel；demineralization；remineralization

Tooth Mousse护牙素从牛奶中提取出来的一种生物活性肽-酪蛋白磷酸多肽（CPP-ACP），内含生物活性钙离子和磷酸离子，可以不断渗入牙齿表面补充早期龋脱矿牙釉质丢失的矿物质，促进牙釉质的再矿化[1]。前一阶段我们的研究显示：Tooth Mousse护牙素在体外实验短期连续使用（7天）能使离体牙釉质在蒸馏水环境中抑制脱矿和促进再矿化，与赵琼芝的研究[2]结果相似。长期使用护牙素（28天）可以加强脱矿的牙釉质再矿化的功效[3]。而在生活中患者无法24h都使用护牙素，每天使用护牙素不同的时间它对牙釉质再矿化的效果是否有不同，这是我们此次实验研究的目的。

1 材料和方法

1.1离体牙制备：因正畸需要拔出的离体前磨牙，经患者知情同意后清洁后置于生理盐水中，放于4℃冰箱内保存。体视镜下挑选釉质表面光滑、颜色正常、无缺损、裂纹及脱矿的离体牙15颗， 清水冲洗后备用。15颗离体牙从冠根向一分为二成为30个牙釉质磨片，长宽高分别为3mm×2mm×1mm。用自凝材料包埋于塑料圈内，根据扫描电镜样品的要求打磨抛光，抛光后的牙釉质面积为3mm×3mm，3mm×3mm以外的釉质表面均用抗酸指甲油覆盖 。

1.2材料和仪器：护牙素（GC Tooth Mousse，GC公司，日本）；扫描电镜（SU8000，日本）。

1.3实验方法：实验：将30个实验样本用数字随机表的方法随机分成5组即4个实验组和1个对照组，每组6个。 实验组均用37.5%磷酸酸蚀浸泡牙釉质2min后分别用Tooth Mousse护牙素涂搽牙面30 min，置于蒸馏水中浸泡，每组浸泡的时间逐步累加， A、B、C、D 实验组分别浸泡时间为1、5、10、20h 。每组待第2天在同一时间涂搽护牙素及在蒸馏水中浸泡的步骤同第1天 ，每天更换蒸馏水一次。每组连续作用5天。接着每组6个样本逐一固定于载物台上，真空喷金，用扫描电镜 （SU8000，日本）观察釉质表面的超微结构，并用能谱检测钙的质量分数，分析各组牙釉质再矿化与浸泡时间的关系。

1.3 统计学方法：所有数据采用SPSS 17.0统计学软件对实验结果进行分析，计量资料用均数±标准差（x±s）表示；两组间均数的对比用成组t检验；多组之间的比较采用单因素方差分析方法，如多组间对比差别有统计学意义，继续进行组间的两两比较。检验水准取α=0.05（双侧）。

2 结果

酸蚀组牙本质小管周围的牙釉质有程度不等的龋蚀孔隙，呈蜂窝状、鳞状改变；实验A、B、C、D 组釉质表面有大量的矿物质沉积，呈球状、块状覆盖于釉质表面，填补釉质表面局限性的小凹陷；实验D组的釉质表面矿物质的沉积比前3组实验组要致密如图1～5。酸蚀组和实验A、B、C、D组釉质表面钙质量分数是（65.74±0.74 、67.38±0.89、67.63±0.56、67.71±0.52、69.11±0.27），和酸蚀组进行多组间样本均数的比较，经方差分析（ANOVA）结果为A、B、C、D 实验组和酸蚀组间的差异有统计学意义（F=21.568，P=0.000<0.01）；用S-N-K法（Student-Newman-Keuls）做多组间样本均数的两两统计比较分析，结果A、B、C组间差异均无统计学意义（P>0.05）；D实验组与A、B、C 组间差异均有统计学意义（P<0.05），如图6～10。

3 讨论

Tooth Mousse护牙素的主要成分酪蛋白磷酸多肽钙磷复合体，因其结构内的磷酸化丝氨酸残基的高负电荷性，使其极易和钙、磷盐结合形成胶体状的酪蛋白磷酸多肽钙磷复合体，起到磷酸钙储存库的作用，有利于牙釉质再矿化而且酪蛋白磷酸多肽具有黏附在牙面和菌斑上的能力并维持3h以上，可有效延长其作用时间[4]。由于它是一种天然产物，安全性更高，因而临床使用范围更广。

各项研究显示酪蛋白磷酸多肽钙磷复合体处于水溶状态下，能被牙面吸收。以钙离子桥作为中介，通过氢键和离子键力以及疏水基团的亲和力进入菌斑，抑制细菌黏附，产生间接抑菌、杀菌作用，并且缓冲菌斑酸性环境， 抑制牙釉质脱矿，增加牙釉质龋损再矿化速率，明显降低患龋率[2，5]。此结果在人磨牙釉质上用显微放射照相技术和显微光密度计得到证实[6]。研究表明[7]将牙釉质片浸于无刺激的pH4.8脱矿液中6天，置于37℃的恒温箱中，每隔两天换一次脱矿液。分成4组每组分别浸于37℃2%CPP-ACFP溶液中1、3、5、10天，每天换再矿化液，其矿化率分别 9.19%、14.27%、29.07%、38.45%。

CPP-ACP加氟形成酪蛋白磷酸肽钙氟磷复合体（CPP-ACFP）。Cross等[8]采用核磁共振光谱分析和X线衍射测定CPP-ACFP复合体的超微结构，证明CPPs的功能结构α（S1）-CN（59-79）与ACFP结合后形成半径（2.12±0.26）nm的无定形的毫微簇，这种毫微簇中每一个缩氨酸结合15个钙离子、9个磷酸根离子和3个氟离子，这对釉质龋损的再矿化作用相当明显。因此CPPs可能是运送钙、磷、氟至牙齿的良好载体[9]。

国内学者张力[10]研究表明，将A、B、C、D组牙釉质片经过人工龋液浸泡和涂0.6%磷酸多肽两个步骤，4组经人工龋液浸泡时间依次为1、2、12、15h，涂磷酸多肽的时间依次为10、20、120、150min，4组的显微硬度依次为25.29、16.24、45.30、76.80（KPa/mm2）。结果显示：前两组的显微硬度试验组与对照组统计学比较无差异，后两组的显微硬度试验组与对照组统计学比较有差异（P<0.01），说明磷酸多肽随作用时间的延长对牙釉质的矿化作用更明显。

刘烨等[11]研究观察基牙金属烤瓷全冠预备后实验组表面开窗区涂布护牙素后扫描电镜下的形态改变 。扫描电镜下实验组牙面表面痕迹较浅，见密集钙质小团的沉积覆盖牙面，对照组基牙表面条纹状痕迹明显，凹凸不平，牙面呈凌乱的疏松无定形状态。证实含氟酪蛋白磷酸肽-磷酸钙复合物可以提高酸蚀牙釉质的耐磨性。

本研究结果显示：A、B、C、D实验组釉质表面有大量的矿物质沉积，呈球状、块状覆盖于釉质表面，填补釉质表面局限性的小凹陷；实验D组的釉质表面矿物质的沉积比前3组实验组要致密见 ，经方差分析（ANOVA）A、B、C、D实验组和酸蚀组间的差异有统计学意义（F=21.568，P=0.000<0.01）；用S-N-K法（Student-Newman-Keuls）做多组间样本均数的两两统计比较分析，结果A、B、C 组间差异均无统计学意义（P>0.05）；D实验组与A、B、C 组间差异均有统计学意义（P<0.05）。

本研究说明Tooth Mousse护牙素体外实验在蒸馏水环境中多次短时间每天20h浸泡离体牙釉质在减少脱矿和促进再矿化方面较实验第2阶段其余3组作用显著。结合我们前一阶段Tooth Mousse护牙素的实验结果：在体外连续使用（7天）能使离体牙釉质在蒸馏水环境中抑制脱矿和促进再矿化，长期使用护牙素（28天）可以加强脱矿的牙釉质再矿化的功效[3]。

综上所述，体外实验在蒸馏水环境中Tooth Mousse护牙素每天20h浸泡离体牙釉质，连续使用7天，能提高酪蛋白磷酸肽钙磷复合体的再矿化作用，如果能延长作用时间再矿化作用会更好。但在患者的临床使用的再矿化作用还受到牙釉质的矿化度、唾液的酸碱度、唾液的量、口腔的菌群、口腔卫生维护的质量等诸多因素的影响，对于龋病易感人群的再矿化作用还有待进一步的研究。

致谢：本研究得到广西大学材料科学与工程学院曾建民教授、顾红工程师和温静娴高级实验师的大力支持，在此表示深深地感谢。

[参考文献]

[1]Rahiotis C，Vougiouklakis G.Effect of a CPP-ACP agent on the demineralization and remineralization of dentine in vitro[J].JDent，2007，35 （8）：695-698.

[2]赵琼芝，蔡瑶.酪蛋白磷酸多肽钙氟磷复合体对牙釉质缺损再矿化的实验研究[J].中华口腔医学杂志，2001，36（6）：421-423.

[3]陈燕，周嫣，黎石坚，等.酪蛋白磷酸多肽钙磷复合体抑制牙釉质脱矿和促进牙釉质再矿化的实验研究[J].中华口腔医学杂志，2013，48（1）：32-36.

[4]魏华，石四箴.酪蛋白磷酸多肽联合钙磷的抗龋作用[J].复旦学报：医学版，2003，30（3）：297-298.

[5]漆明，王张，阮梅生，等.α-淀粉酶与蚁龋细菌的相关性研究[J].口腔医学，2002，22（2）：67-69.

[6]Reynolds EC.Remineralization of enamel subsurface lesions by casein phosphopeptide stabilized calcium phosphate solutions[J]. J Dent Res，1997，76（9）：1587-1595.

[7]赵琼芝，FanCail.酪蛋白磷酸肽钙氟磷复合体溶液对牙釉质缺损的再矿化作用[J].实用预防医学，2001，8（1）：6-8.

[8]Cross KJ，Huq NL，Stanton DP，et al.NMR studies of a novel calcium， phosphate and fluoride delivery vehicle-alpha-casein by stabilized amorphous calcium fluoride phosphate nanocomplexes [J].Biomat，2004，25（20）：5061-5069.

[9]Rose RK.Effects of an anticariogenic casein phosphopeptide on calcium diffusion in streptococcal model dental plaques[J].Arch Oral Biol，2000，45（7）：569-575.

[10]张力，李宗同，石玉琢.磷酸多肽对牙齿再矿化的实验研究[J].现代口腔医学杂志，1999，13（1）：15-17.

[11]刘烨，陈溯，张振庭.含氟酪蛋白磷酸肽-磷酸钙复合物对牙齿耐磨性的影响[J].北京口腔医学，2012，2（20）：74-76.

[收稿日期]2014-05-12 [修回日期]2014-06-28

编辑/何志斌