延胡索氯仿提取物对玉米、大豆几种病原真菌的抑菌活性研究

摘 要：为了对三江平原玉米、大豆常发生病害进行更好的治理与防治，通过采用菌丝生长速率法和载玻片法，研究了延胡索氯仿提取液对玉米、大豆几种常见真菌病害的离体抑菌活性。菌丝生长速率法试验结果表明：延胡索氯仿提取液对玉米纹枯病和大豆灰斑病的抑制率最高，均在80%以上，EC50值52.98～58.98 mg/L；孢子萌发法试验结果表明：对所供试的病原真菌孢子萌发抑制率均很高，其中对玉米小斑病和大豆灰斑病的孢子萌发抑制率达到了100%；活体生物防治试验结果表明：除对玉米纹枯病的防治效果达到了61.46%外，对其他病害防治效果均在60%以下。

关键词：延胡索；菌丝生长速率；孢子萌发；生物防治

中图分类号：S432 文献标志码：A 论文编号：2013-0597

0 引言

化学农药的使用在防治作物病虫害，保证作物稳产和高产方面发挥了重要作用[1]，但长期依赖和大量使用有机合成化学农药，已经带来了众所周知的环境污染、生态平衡破坏和食品安全等一系列问题，对推动农业经济实现持续发展带来许多不利的影响。因此，开发生物活性高、对非靶标生物安全、与环境可容性强的生物农药已成为农药未来发展的新趋势。

延胡索为罂粟科紫堇属植物。具有活血化瘀、理气止痛功效，其主要活性成分为生物碱，其中以延胡索甲、乙、丑素等为主[2]。活性成分的常用提取方法有渗漉法[3]、醇回流法[4]和超声提取法[5]。延胡索的镇痛、镇静催眠、抗冠心病等作用已得到广泛研究与临床应用。但对抑菌方面的活性少见报道，胡定慧等[6]得出延胡索不同提取物对金色葡萄球菌具有很高抑制作用，桑晓媛等[7]利用延胡索生物碱提取物对肝癌细胞的体外细胞毒活性测定，结果表明对SMMC27721的生长抑制活性最高，IC50约为35 μg/mL。前人对延胡索提取物的研究均是临床上的应用研究为主，对植物病害的研究尚属空白。为此，笔者以延胡索提取物为药剂，用传统的体外抑菌活性试验方法，初步研究延胡索提取物对玉米、大豆几种常发真菌病害进行抑菌研究，为进一步开发延胡索在植物农药方面的研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试药剂

延胡索（购于佳木斯医药店）；纯品多菌灵（50%可湿性粉剂）北京联兴化工有限公司。

1.2 供试菌种

供试菌种有玉米小斑病菌（Bipolaris maydis）、玉米大斑病菌（Exserohilum turci-cum）、玉米纹枯病菌（Rhizoctonia solani Kuhn）、大豆灰斑病菌[cercosporidium sofinum （Hara） Liu & Guo]、大豆菌核病菌（Sclerotinia sclerotiorum （Lib.） de Bary）以上菌种由沈阳农业大学植物保护学院提供。

1.3 培养基

马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂20 g，水1000 mL。

1.4 试验方法

1.4.1 延胡索氯仿提取液的制备 准确称取延胡索粉末10 g，蒸馏水浸泡1天，离心弃沉淀，得粗提液，减压浓缩至50 mL，该溶液氯仿萃取，充分振荡，静置，直到两相液面完全分开。用分液漏斗将有机溶剂相与水相分开，收集有机溶剂，减压浓缩后无菌水溶解，配制成125 mg/L、250 mg/L、500 mg/L、1000 mg/L的待测药液。

1.4.2 菌丝生长速率试验 在无菌操作条件下，取一定量的植物提取物与已溶化并冷却至45～50℃的培养基充分混合后，倒入直径为9 cm的培养皿中制成含药培养基，用无菌打孔器在事先培养好的植物病原真菌的菌丝平展处打直径6 mm小菌饼，接到上述平板中央，每皿1片，每处理重复3次，以无菌水作空白对照。3天后用十字交叉测量法测量菌落直径，并计算菌丝生长抑制率[8-9]。

1.4.3 孢子萌发试验法 将平皿内培养一定时间的病原菌孢子用灭菌水配成每10×视野中100～120个的孢子悬浮液，将稀释好的孢子悬浮液移至6孔凹板板孔中，盖上盖放入恒温培养箱中培养24 h或48 h后调查并计算孢子萌发率[9-10]。

1.4.4 活体试验 用药前一天选择生长势一致的3叶期盆栽幼苗，按处理分组编号待用。先用棉团沾上酒精将其叶片擦净，干后用细雾喷雾器将不同处理的药剂均匀地喷在叶片正背面上，待药剂充分晾干后用细雾喷雾器在幼苗上均匀喷雾接种孢子悬浮液。接种后立即移至恒温室（26～28℃）中，并放置加湿器（RH 100%），12 h黑暗、12 h光照交替使用，从而诱发病害，并每天观察玉米苗生长有无异常，当空白对照病斑稳定后即可根据病斑多少进行分级调查[10-11]。

病情指数={[∑（各级发病数×该级代表值）]/（考察总苗数×最高级代表值）}×100%…（1）

防治效果=[（对照病情指数-处理病情指数）/对照病情指数]×100%…（2）

1.5 数据分析

统计分析采用DPS 7.05及Excel。

2 结果与分析

2.1 延胡索氯仿提取液对供试真菌菌丝生长速率抑制效果研究

从图1中可以看出，延胡索氯仿提取液对玉米纹枯和大豆灰斑2种病原真菌菌丝生长的抑制效果最好，在浓度为1000 mg/L时分别达到了81.79%和85.36%，对大豆菌核病菌的抑制效果最差，为65.18%，对其他2种病菌的抑制率在70%以上，当浓度降到125 mg/L时，延胡索氯仿提取液对玉米纹枯和大豆灰斑的抑制率也在70%左右，而对其他3种病菌的抑制率则降到了60%以下。

根据上述对菌丝生长抑制率的结果，应用DPS程序进行毒力回归分析并计算出毒力回归方程，求出抑制中浓度的浓度剂量，结果见表1。从表1中可以看出，延胡索氯仿提取液对大豆灰斑病菌和玉米纹枯病菌的EC50值均低于60 mg/L，说明抑菌活性很高；其次是对玉米大斑病菌和玉米小斑病菌的EC50值在150 mg/L以下；对大豆菌核病菌的抑制效果最差。

2.2 延胡索氯仿提取液对供试真菌孢子萌发抑制效果研究

由表2可以看出，在浓度为1000 mg/L和500 mg/L时，延胡索氯仿提取液对玉米小斑病菌和大豆灰斑病菌的孢子萌发率均达到了100%，高于对玉米大斑病菌的抑制率，在浓度为250 mg/L时，对3种病原真菌的孢子萌发抑制率均超过了70%，说明延胡索氯仿提取液对3种病原真菌的孢子萌发均具有较高的抑制率，对玉米小斑病菌和大豆灰斑病菌在浓度为1000 mg/L与500 mg/L时抑制率无显著差异。

2.3 延胡索氯仿提取液对供试作物真菌病害活体防治效果研究

从表3中可以看出，延胡索氯仿提取液对玉米纹枯病的防治效果达到了61.46%，对玉米大斑病和大豆菌核病的防治效果均在50%以上，均与标准药剂相比差别仍较大，对大豆灰斑病和玉米小斑病的防治效果较差。

3 结论与讨论

化学药剂防治玉米、大豆等作物上常发病害是控制其发生、减少损失的最有效途径之一。而长期使用化学合成杀菌剂会使病菌对药剂产生不同程度的抗药性。所以有必要寻找开发低毒、安全的新型生物药剂。

本试验采用菌丝生长速率法测定延胡索氯仿提取液对供试真菌的抑菌作用，结果显示，延胡索氯仿提取液对玉米纹枯病菌和大豆灰板病菌菌丝生长抑制率最高，孢子萌发试验表明对玉米小斑病菌和大豆灰板病菌的抑制效果最好，达到了100%，活体生物防治试验结果发现对玉米纹枯病的防治效果最高，达到了61.46%，对其他供试病菌防治效果较差。室内药效测定与田间试验相比省工省时，但是室内药效测定结果与田间防治效果有一定差别，在实际生产中一旦药剂施入田间，会受到天气变化，以及动植物及人为原因等其他外界条件的影响。这些特点在室内药剂试验中无法体现，所以不能只凭借室内试验完全断定其生物活性大小。在抑菌活性物质筛选[11-12]中应采用多种方法有机结合，药剂使用得靠多次田间药效试验结果来证明。

延胡索是一种具有很好开发价值的有毒植物抑菌剂资源，从中提取分离出的活性物质对某些病菌具有很高的抑菌活性，目前对延胡索已经开发出的生物碱类对动物体及人体肿瘤、大肠杆菌具有很高的抑菌作用，已有报道[13-15]。本研究结果表明延胡索氯仿提取液通过不同试验方法对所供试的病原真菌具有较高抑菌活性，但对其作用机理以及田间试验等还有待于进一步研究。

参考文献

[1] 赵磊，杜娟，卜春亚，等.瑞香狼毒活性物质对草莓灰霉病菌的抑制作用[J].植物病理学报，2012，42（4）：411-417.

[2] 黄康泰.常用中药成分与药理手册[M].北京：中国医药科技出版社，1994：874.

[3] 桑彤，谢培德.延胡索渗漉提取工艺的优选[J].基层中药杂志，2000，14（3）：35-36.

[4] 孙百虎，尚平，卜欣立.元胡中生物碱的醇回流提取[J].河北化工， 2008，31（2）：41-44.

[5] 秦秀蓉，汤燕.超声法提取延胡索有效部分的工艺研究[J].成都中医药大学学报， 2005，28（4）：47-52.

[6] 胡定慧，丁建刚，张敏，等.延胡索提取物抑菌活性的初步研究[J].辽宁中医杂志，2007，34（4）：496-497.

[7] 桑晓媛，张磊，刘立，等.延胡索生物碱的提取及其抗肝肿瘤活性研究[J].浙江理工大学学报，2009，26（5）：754-756.

[8] 吴文君.植物化学保护试验技术导论[M].西安：陕西科学技术出版社，1988.

[9] 方中达.植病研究方法（第3版）[M].北京：中国农业出版社，1998.

[10] 慕立义.植物化学保护研究方法[M].北京：中国农业出版社，1991.

[11] 申晓慧，李翔国，刘海峰.延胡索、白头翁提取液的离体抑菌作用测定[J].延边大学农学学报，2006，28（1）：35-40.

[12] 申晓慧，姜成，张敬涛.两种有毒植物提取物的抑菌活性研究[J].作物杂志，2009（4）：35-37.

[13] 倪长春，沈宙，顾必文，等.杀菌剂生物活性筛选离体活体兼顾的重要性[J].浙江化工，2000（S1）：61-64.

[14] 张穗.杀菌剂生物测定技术[J].植物保护，1999，25（3）：35-37.

[15] 贺凯，高建莉，赵光树，等.延胡索化学成分、药理作用及质量控制研究进展[J].中草药，2007，38（12）：1909-1912.