松科3种植物抗寒性研究

卿龙

[摘 要] 通过对松科3种植物叶片的可溶性糖含量、脯氨酸含量、自由水与束缚水以及叶绿素含量等指标的测定，结果表明：可溶性糖与脯氨酸含量均随温度的自然降低而不断增加；叶片总含水量较低，而束缚水/自由水较高，叶绿素含量则随着气温的自然降低而减少，但类胡萝卜素/叶绿素总含量的比值较高；综合各项指标，松科3种植物的抗寒性强弱顺序为：樟子松>青海云杉>油松。

[关键词] 油松 樟子松 青海云杉 叶片 抗寒性

绪论

樟子松（Pinus sylvestris var. mongolicaLitv）、青海云衫（Picea asperata Mast.）和油松（Pinus tabuliformis Carr.）均为松科（Pinaceae）植物，松科是裸子植物中最大的一科，有10属，230种，主产北半球。我国有10属113种，分布遍全国，绝大多数为森林树种和用材树种，在东北、华北、西北、西南及华南地区高山地带组成大片森林，有些种类可供采脂、提炼松节油等多种化学原料，有的种类种子可食或供药用，有些可作园林绿化树种。

松科植物的化学成分较复杂，其共同的特点是含有树脂及挥发油，缺乏生物碱，缺少双黄酮。树脂贮存在树脂道内，与挥发油共存。树脂中含有多种有机酸（如松香中含有90%以上的树脂酸），还有树脂醇、树脂酯及大量的树脂烃类。挥发油含于针叶及树脂中，挥发油中含有多种烯类。松科植物种子油中均含有不常见的3种共存的特征脂肪酸，对顺-5，9十八碳二烯酸（18：2）、顺-5，9，12十八碳三烯酸（18：3）和顺-5，11，14，二十碳三烯酸。

目前对松科植物的研容主要集中在：育苗与造林技术、茎的初生结构比较以及松科植物表皮的电镜扫描，松科植物的化感活性等方面。

本次试验针对松科3种植物，在自然降温过程中抗寒性进行研究，测定了游离脯氨酸含量、可溶性糖含量、自由水与束缚水含量以及叶绿素含量这4个指标。为进一步掌握其生长生理、生态特性，扩大引种提供理论支持[1]。

一、材料与方法

1.实验材料

2.试验方法

2.1 游离脯氨酸含量测定（茚三酮显色法）

称取0.2g鲜叶，剪碎置于具塞试管中，加3%的磺基水杨酸溶液5ml，沸水浴中浸10min，冷却至室温，取上清液2ml，加2ml冰乙酸和2.5%酸性茚三酮显色液3ml。沸水浴中显色40min。冷却，用5ml甲苯萃取，测定520nm波长下的消光值。

脯氨酸含量（ug/g）=（c*v/a）/w

C：提取液中脯氨酸浓度（ug） v：提取液总体积（ml）

W：植物组织鲜重（g） a：测定时所吸取的体积（ml）

2.2 可溶性糖含量测定（蒽酮法）

称取0.2g鲜叶，剪碎置于具塞试管中，加10ml蒸馏水于沸水浴中浸1h，提取液过滤入25ml的容量瓶定容，吸取0.2ml提取液加1.8ml蒸馏水，依次加0.5ml蒽酮乙酸乙酯和5ml浓H2SO4于沸水浴中显色1min，冷却至室温后测定630nm波长下的消光值。

可溶性糖含量（%）=（c*v/a*n）/（w*106）

C：标准曲线求得糖量（ug） a：吸取样品液体积（ml）

V：提取液量（ml） n：稀释倍数 w：植物组织鲜重（g）

2.3 自由水与束缚水含量测定

2.3.1 植物组织中总含水量的测定

（1）取称量瓶3只（三次重复，下同），依次编号并分别准确称重。（2）选取生长一致的待测的植物数株，各选部位、长势、叶龄一致的有代表性叶子数片。用剪刀剪取针叶片150片（注意避开粗大的叶脉），立即装到上述称量瓶中（每瓶随机装入50片），盖紧瓶盖并精确称重。（3）将称量瓶连同小圆片置烘箱中105℃下烘15min以杀死植物组织细胞，再于80～90℃下烘至恒重（称重时须置干燥器中，待冷却后称）。设称量瓶重量为W1，称量瓶与小圆片的重量为W2，称量瓶与烘干的小圆片的重量为W3（以上重量单位均设为g，下同）。则植物组织的总含水量（%）可按下式计算

植物组织的总含水量（%）=（W2-W3）/（W2-W1）×100

根据上式可分别求出三次重复所得到的组织总含水量的值并进一步求出其平均值。

2.3.2 植物组织中自由水含量的测定（1）另取称量瓶3只，编号并分别准确称重。（2）用剪刀剪取小叶圆片150片（植物材料的选取同上），立即随机装入三个称量瓶中（每瓶装50片），盖紧瓶盖并立即称重。（3）三个称量瓶中各加入60%～65%的蔗糖溶液5ml左右，再分别准确称重。（4）各瓶于暗处置4～6h（经减压处理后，只需在暗处置1h），其间不时轻轻摇动。到预定的时间后，充分摇动溶液。用阿贝折射仪（见附注）分别测定各瓶糖液浓度，同时测定原来的糖液浓度。

设称量瓶重量为W1，称量瓶与小圆片的重量为W2，称量瓶与小圆片及糖液的重量为W4，糖液原来的浓度为C1，浸过植物组织后的糖液的浓度为C2。则植物组织中自由水的含量（%）可由下式算出：植物组织中自由水的含量（%）=（W4-W2）×（C1-C2）/[（W2-W1）×C2]×100

根据上式同样可求出三个不同的测定值并进一步求出其平均值。

2.3.3 植物组织中束缚水含量的计算

植物组织中束缚水的含量（%）=组织总含水量（%）-组织中自由水含量（%）

2.4 叶绿素含量测定

2.4.1 取新鲜植物叶片或干材料，擦净组织表面污物，剪碎，混匀。

2.4.2 称取剪碎的新鲜样品0.2g，共3份，分放研钵中，加少量石英砂和碳酸钙及2ml～3ml96%乙醇，研成匀浆，再加乙醇10ml，继续研磨至组织变白。静置3～5min。

2.4.3 取滤纸一张，置漏斗中，用乙醇润湿，沿玻棒把提取液倒入漏斗中，过滤到25ml棕色容量瓶中，用少量乙醇冲洗研钵、研棒级残渣数次，最后连同残渣一起倒入漏斗中。

2.4.4 用滴管吸取乙醇，将滤纸上的叶绿体色素全部洗入容量瓶中。直至滤纸和残渣中无绿色为止，最后用乙醇定容到25ml，摇匀。

2.4.5 把叶绿体色素提取液倒入光径1cm的比色杯中。以96%乙醇为空白对照，在波长665nm、649nm和470nm下测定光密度。

2.4.6 按公式（1）、（2）、（3）分别计算叶绿素a、b和类胡萝卜素的浓度（mg·dm-3）。（1）、（2）式相加即得叶绿素总浓度。

2.4.7 求得色素的浓度后再按下式计算组织中各色素的含量（用mg·g-1鲜重或干重表示）；

二、结果与分析

由图表2可以看出这3种松科植物的可溶性糖含量的总体趋势一致，它们均随着气温的自然降低而不断增加。青海云杉由7月初的10.36%增长到12月中旬的46.63%，樟子松从7月初的13.93%增长到12月中旬的48.17%，油松从7月初的9.66%增长到12月中旬的45.06%，变化无明显差异。从不同时间的增长幅度看，油松的可溶性糖含量在10月～11月变化最大，从10月的16.4%增加到11月的30.39%，增长率为85.3%，樟子松从10月的19.55%增加到11月的31.91%，增长率为63.22%，青海云杉从10月的19.48%增加到11月的29.37%，增长率为50.77%，11月～12月可溶性糖含量变化，青海云杉和樟子松大致一样。青海云杉从11月初的29.37%增加到12月初的35.23%最后增加到12月中旬的46.63%，增长率为58.77%；樟子松从11月的31.91%增加到12月初的36.32%最后增加到12月中旬的48.17%，增长率为50.96%；油松从11月的30.39%增加到12月初的35.77%最后增加到12月中旬的45.06%，增长率为48.27%。

2.脯氨酸含量测定

该指标下3种植物的抗寒性强弱顺序：樟子松>青海云杉>油松。在逆境条件下（旱、盐碱、热、冷、冻），体内脯氨酸的含量显著增加。在一定程度上植物体内脯氨酸含量反映了植物的抗逆性，抗性强的品种往往积累较多的脯氨酸。由于脯氨酸亲水性极强，能稳定原生质胶体及组织内的代谢过程，因而能降低凝固点，有防止细胞脱水的作用。要想具备最大的抗冻力，在秋的抗寒锻炼中必将发生一系列的深刻变化，也是必须经过的过程，随着季节的变化植物的抗冻力起伏极大，在低温条件下，植物组织中脯氨酸增加，可提高植物的抗寒性，因此，可作为抗寒育种的生理指标。脯氨酸能降低细胞渗透势，还可使蛋白质束缚更多的水分子。脯氨酸含量总体趋势随温度的自然降低而升高。7月至10月脯氨酸含量樟子松变化较明显，樟子松从7月的0.1036mg/g增长到10月的0.1955mg/g，增长率为88.715%；青海云杉从7月的0.1393mg/g增长到10月的0.1948mg/g，增长率为42.43%；油松从7月的0.0966mg/g增长到10月的0.164mg/g，增长率为69.77%；10月至11月3种植物的脯氨酸含量均明显增加，樟子松从10月的0.1955mg/g增长到11月的0.3191mg/g，增长率为63.22%；青海云杉从10月的0.1948mg/g增长到11月的0.2937mg/g，增长率为50.77%；油松从10月的0.164mg/g增长到11月的0.3039mg/g，增长率为85.3%；11月至12月脯氨酸含量增加，樟子松从11月的0.3191mg/g增长到12月初的0.3632mg/g，增长率为13.82%，再增长到12月中旬的0.4817mg/g，增长率为32.63%；青海云杉从11月的0.2937mg/g增长到12月初的0.3523mg/g，增长率为16.63%，再增长到12月中旬的0.4663mg/g，增长率为32.36%；油松从11月的0.3039mg/g增长到12月初的0.3577mg/g，增长率为15.04%，再增长到12月中旬的0.4506mg/g，增长率为25.97%。根据数据可以看出该抗寒指标下抗寒性强弱顺序：樟子松>油松>青海云杉。

3.叶片的水分状态

植物体内存在2种状态的水分，分为束缚水和自由水，束缚水不可以参与各种代谢过程，但自由水却具备。一般情况下束缚水含量高则植物的抗逆性就强。

由图表3、4、5可以看出松科3种植物自由水的含水量随温度的下降而减少，青海云杉的自由水含量由11月初的24.38%减少到12月中旬的5.95%，油松从11月的24.38%减少到12月中旬的8.72%，樟子松的自由水含量从11月的21.89%减少到12月中旬的4.87%。叶片含水量也逐渐减少，青海云杉的叶片含水量由11月初的57.18%减少到12月中旬的49.22%，油松从11月的57.35%减少到12月中旬的50.91%，樟子松的叶片含水量从11月的54.73%减少到12月中旬的48.01%。而束缚水含量均上升，青海云杉的束缚水含量由11月初的32.8%增加到12月中旬的43.26%，油松从11月的32.82%增加到12月中旬的42.2%，樟子松的叶片含水量从11月的32.84%增加到12月中旬的43.14%。从束缚水/自由水来看，樟子松的束缚水与自由水比值为8.86，是这3种植物中最高的，从此指标看出抗寒性强弱顺序：樟子松>青海云杉>油松。

4.叶绿体色素含量的变化

由图表5可知，低温条件下，3个树种的叶绿素总含量较低，在0.27—0.77 mg/g之间，但类胡萝卜素/叶绿素总含量的比值较高，在0.25—0.87之间，其中青海云杉较低为0.25，最高的樟子松达0.87，油松居中为0.39，随着气温的降低，3 种松科植物叶片叶绿素a、叶绿素b和总叶绿素含量均存在一定差异， 总体趋势均随温度的自然降低而降低， 但三者降低幅度不同。青海云衫的叶绿素总含量从11月的1.4mg/g降低到12月中旬的0.77mg/g，油松的叶绿素总含量从0.79mg/g降低到0.41mg/g，樟子松的叶绿素总含量从11月的0.85mg/g降低到12月中旬的0.27mg/g，类胡萝卜素含量变化不大，类胡萝卜素/叶绿素比值樟子松的最为明显，从0.38增长到0.87，油松的从0.35增长到0.39，青海云杉从0.28减少到0.25，由此指标看出植物抗寒性强弱为：樟子松>油松>青海云杉

三、讨论

松属树木因其适应性强， 耐干旱贫瘠， 能耐-60℃的低温或50℃的高温等特点，适合北半球的生长环境 [2]。青海云杉林天然分布于甘肃、宁夏、内蒙古等省，青海省水平分布广阔，分布区大致位于北纬38°35′—34°55′；东经98°20′—102°25′，面积约占全省针叶林总面积的44%。油松林在青海省主要分布在大通河、湟水、黄河的河谷地带，大致位于北纬35°32′—37°09′；东经101°37′—103°34′。取样地点位于青海西宁城北区二十里铺，海拔2232m， N：36°38′08″，E：101°44′12″。

1.可溶性糖含量的变化 由图表1可以看出松科3种植物的可溶性糖含量随温度的自然降低而增加，这一点与蔡仕珍等的研究结果一致[3-4]。可溶性糖在低温胁迫时的积累可提高细胞渗透压， 从而增强保水能力。糖还具有冰冻保护剂用， 防止蛋白质在结冰和解冻时发生凝固变性[5]。可溶性糖作为渗透保护物质，可提高细胞液的浓度，增加细胞持水力及组织中非结冰水，从而降低细胞质的冰点，是植物抵御低温的重要保护性物质。当植物体受到低温胁迫或温度的自然降低时，体内的可溶性糖含量就会增加，来保护植物体不受到伤害，抗寒性越强的品种可溶性糖含量增加得越多。

2.脯氨酸含量 脯氨酸（Proline）是最重要的有机渗透调节物质。几乎所有的逆境，如干旱、低温、高温、营养不良、病害和大气污染等都会造成植物体内脯氨酸的积累[6]。脯氨酸是一种亲水性氨基酸，能缓解因低温脱水造成的渗透胁迫[7]。脯氨酸具有较强的水合能力，在植物逆境胁迫下， 是一种渗透保护剂。在植物受低温胁迫时，脯氨酸的增加有助于细胞或组织的保水，同时还可作为碳水化合物的来源、酶和细胞结构的保护剂。脯氨酸的这种提高植株耐受胁迫的功能，可能是通过保保护植物中线粒体电子传递链，诱导保护蛋白、泛素、抗氧化酶和脱水素等保护物质的含量增加，启动相应的抗胁迫代谢途径而实现的[8]。正常情况下，植物体内脯氨酸含量并不高，但遭受低温胁迫后体内的脯氨酸含量往往增加，因此可作为植物抗寒性的重要测定指标[9]。从图表2可以看出，脯氨酸含量随着温度的自然降低而增加，由图表3数据显示，樟子松的脯氨酸含量从7月的0.1036mg/g增长到12月中旬的0.4817mg/g，油松从7月的0.0966mg/g增长到12月中旬的0.4506mg/g，青海云杉从7月的0.1393mg/g增长到12月中旬的0.4663mg/g。反映了植物在一定程度上的受害程度，以及植物对低温胁迫的忍耐及抵抗能力。水溶性最大的氨基酸是脯氨酸，脯氨酸在植物的渗透调节中起重要作用，其水溶液具有很高的水势，具有很强的水合能力。脯氨酸溶液即使在含水量很低的细胞内，仍能维持正常的生命活动，提供足够的自由水。

3.水分状态 自由水含量随温度的自然降低而减少，束缚水含量增加，从束缚水/自由水来看，樟子松的束缚水与自由水比值为8.86。植物体内的水分以自由水和束缚水2种状态存在，自由水可以参与各种代谢过程，而束缚水不能，其作用在于稳定原生质的结构。一般认为自由水含量高，植物代谢活动旺盛，束缚水含量高，表明抗性强[10]。束缚水含量较高，组织K+和可溶性糖都较高.但不同树种间仍有较大差异，束缚水/自由水比值高，束缚水多而自由水非常少，低温时少量的自由水容易撤退到细胞外，而束缚水不能结冰却可以稳定细胞质，致使细胞内可结冰的水非常少，所以虽然溶质（可溶性糖和K+）较少，但冰点仍会很低，所以耐冻性很强。细胞内大量累积可溶性溶质（可溶性糖、氨基酸、K+等） ， ABA 大量合成，植物生长停止、进入休眠，抗寒性大大提高[11]。

4.叶绿体色素含量 松树一般在冬天应是绿色，属常绿越冬植物，但油松、青海云杉和樟子松的针叶部分发黄，尤以樟子松最为明显；由表5可知，3个树种均拥有较高的类胡萝卜素含量，从类胡萝卜素/叶绿素比值看，樟子松的最大，说明樟子松在这3种松科植物中抗寒性最强。胡萝卜素除了可以吸收光能用于光合作用外， 还是植物体内的保护物质，可以清除逆境或衰老过程中累积的自由基和活性氧[12-14]。

植物材料在测定植物抗寒力时常常是离体的，且只能是温度影响它，而在自然界植物的生长是受到多种生物因子和环境因子的综合作用，所以对植物抗寒力评估时必须要考虑到其抗寒力也必然受到温度以外的其他因子影响这个因素[15]。

四、结论

通过对松科3种植物叶片的可溶性糖含量、脯氨酸含量、自由水与束缚水以及叶绿素含量等指标的测定，结果表明：

1.脯氨酸含量随着温度的自然降低而增加，在该指标下抗逆性强弱顺序：樟子松>油松>青海云杉。

2.自由水随着植物抗寒性增强而减少，束缚水增加，该指标下抗寒性强弱顺序：樟子松>青海云杉>油松。

3.可溶性糖随植物的抗寒性增强而增加，该指标下3种植物的抗寒性强弱顺序：樟子松>青海云杉>油松。

4.叶绿素含量随温度的自然降低而减少，类胡萝卜素含量较稳定。此指标下植物抗寒性强弱为：青海云杉>油松>樟子松。

综合各项指标，松科3种植物的抗寒性强弱顺序为：樟子松>青海云杉>油松。

参考文献

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致 谢

本次试验和撰写论文的过程中，非常感谢韦梅琴老师对我的精心指导和帮助，以及同学给予的帮助。在论文完成之际，谨向韦老师致以崇高的敬意和衷心的感谢。感谢农林系的各位老师对我这四年来的辛勤栽培。谢谢大家！