李虎 韩金祥 王延宙等
摘要:目的 探讨1例成骨不全症患者胶原合成的特征。方法 应用3H-脯氨酸掺入法及Elisa法分别检测成骨不全症及发育性髋关节脱位两种来源的皮肤成纤维细胞的胶原合成及分泌情况。结果与结论 与发育性髋关节脱位组相比成骨不全症患儿细胞内及细胞外胶原含量显著降低(P<0.05),提示该例成骨不全患者胶原合成的异常。
关键词:成骨不全症;成纤维细胞;胶原合成
成骨不全症(Osteogenesis Imperfecta, OI)是一种胶原合成代谢异常引起的结缔组织疾病,临床上常以骨质疏松和骨的脆性增加,蓝巩膜,牙本质形成不全,早熟性耳硬化为诊断标准,群体发病率约为1/15,000~25,000[1],其中约90%的患者系I型胶原合成基因COL1A1及COL1A2突变所致[2]。成骨不全患者胶原代谢的研究已成为间接揭示该病发病机制的重要方面,本文在体外培养成骨不全症患者成纤维细胞的基础上定量分析其胶原合成的特征。
1 资料与方法
1.1一般资料 经山东省医学科学院伦理委员会批准并经患者及家属知情同意后,本实验室在山东省立医院收集实验组成骨不全症患者及对照组发育性髋关节脱位患者(Developmental dislocation of the hip,DDH)各一例大腿外侧皮肤标本,同时调查了患者信息。患者,男,8岁,因"反复四肢骨折8年"入院,出生时即左侧股骨中段骨折,此后因翻身、学走路等反复骨折8次,父母非近亲婚配,家族中均无此类骨折史。查体:身高110cm,体重26kg,双巩膜蓝色,牙齿易碎,桶状胸,其它未见异常。X线片示:各长骨骨干细长,骨皮质变薄,双侧股骨弯曲畸形。根据病史、临床表现及X线结果诊断为成骨不全症。发育性髋关节脱位患者与其性别、年龄一致,未患有其它疾病。
1.2主要仪器及试剂 SN-6930型液态闪烁计数器(上海核所日环光电有限公司),ZFV型微量多头细胞样品收集器(上海医科大学 浙江绍兴东浦医疗仪器厂),L-[2,3-3H]-Proline(中国同辐股份有限公司),DMEM培养基(Gibco),胎牛血清(Gibco),胰酶细胞消化液(碧云天),人I型胶原酶联免疫定量检测试剂盒(美国R&D System公司),胃蛋白酶(Sigma),BCA蛋白定量试剂盒(贝博生物),非均相闪烁液(2.5g PPO,0.2g POPOP,100ml 无水乙醇,二甲苯补足至500ml),β-氨基丙腈(Sigma),L-抗坏血酸(Sigma)。
1.3方法
1.3.1成纤维细胞体外培养 用胰蛋白酶消化法分别培养两种来源成纤维细胞,无菌条件下漂洗剪碎组织,消化下成纤维细胞后,转移至含10%胎牛血清的DMEM中,于37℃,5% CO2培养箱培养,待接近完全贴壁后用胰酶消化传代,取第四代作为实验用细胞。
1.3.23H-脯氨酸掺入实验 两组细胞每组6个副孔,以2.5×104个/0.5ml接种于24孔培养板培养过夜至接近完全贴壁,更换含有100μg/mlβ-氨基丙腈、50μg/ml L-抗坏血酸的DMEM无血清培养基,37℃,5%CO2预培养30min后,于每孔内分别加入1μci 3H-脯氨酸,继续培养24h。用胃蛋白酶消化法检测细胞分泌至培养液中胶原含量[3],细胞内胶原含量测定采用胰酶消化,PBS清洗,多头细胞样品收集器收集于玻璃纤维滤膜上并依次用PBS,5%TCA和无水乙醇洗涤固定细胞后将其置于闪烁瓶,每瓶加入5ml闪烁液,液相闪烁计数仪上测定CPM值。总胶原合成量为细胞内及分泌至培养液中胶原含量之和,另以相同条件下培养细胞进行计数,胶原合成结果用细胞数进行校正(cpm/103细胞)。
1.3.3人I型胶原酶联免疫定量检测 两组细胞每组3个副孔,以105个/2ml 接种于六孔板培养过夜至接近完全贴壁,更换含50μg/ml L-抗坏血酸的DMEM无血清培养基继续培养24h,收集细胞及培养液上清用于I型胶原酶联免疫测定,同时对细胞裂解液进行总蛋白定量。测定结果以每微克细胞总蛋白中细胞内外I型胶原总含量进行比较(pg/μg总蛋白)。
2 统计及分析
所得资料用t检验进行比较分析。
3 结果
3.13H-脯氨酸掺入值比较 细胞内、细胞外及总胶原含量比较,OI组成纤维细胞3H-脯氨酸掺入值明显低于DDH对照组,经统计学比较有显著性差异(P<0.05),见表1。
3.2I型胶原含量比较 每微克细胞总蛋白中I型胶原总含量进行比较可见,OI组细胞合成及分泌I型胶原总含量明显低于DDH对照组(P<0.05),见图1。
4 讨论
COL1A1及COL1A2分别编码产生组成I型胶原的两条α1链及一条α2链,两者突变均可导致I型胶原合成异常。根据Sillence分型标准可将此类突变的患者归为I-IV型,本例患者出生后多次骨折致股骨畸形,蓝巩膜,牙本质发育不全,考虑为IV型成骨不全患者,其病因为COL1A1或COL1A2突变所致,因此胶原合成能力可能存在不同程度异常。脯氨酸在I型胶原中占有一定比例,其掺入多少可反映皮肤成纤维细胞胶原合成的情况,作为研究胶原合成的常用方法其效果稳定、可信。胶原在细胞内合成后胶原前体后,分泌到细胞外转变为成熟胶原,进一步交联聚合成三螺旋结构,由于不同来源细胞合成蛋白能力往往有所不同,因此应用Elisa法定量I型胶原后通过细胞总蛋白含量进行校正可真实反映不同来源细胞胶原合成能力。发育性髋关节脱位目前尚无明确结论证实其胶原合成异常,因此作为本病对照可提供胶原代谢方面的参考[4]。
Cabral等[5]在蛋白水平对特定位点突变的成骨不全患者胶原合成方面的研究显示:患者胶原合成量减少,严重者胶原结构异常。本文在细胞水平对比研究了成骨不全来源的成纤维细胞胶原合成情况,与国外研究结论一致。两种方法的结果都反映出该例患者胶原合成能力下降,这也与其由于I型胶原合成减少导致的蓝巩膜、多发骨折等临床病征一致。
另外,本研究仅对一例特定分型的成骨不全患者细胞水平的胶原合成情况进行了定量对比研究,有学者对大量样本的回顾分析认为I型胶原三螺旋区域不同位置、不同类型突变与其表型有一定相关性[6],而在体外细胞胶原合成水平是否有一定的关系尚需大量样本的深入研究。
参考文献:
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[2]Pollitt R, McMahon R, Nunn J, et al. Mutation analysis of COL1A1 and COI1A2 in patients diagnosed with osteogenesis imperfecta type I-IV[J]. Human Mutation,2006.
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[4]王利臣.先天性髋关节脱位病因学研究进展[J].中国现代医生,2008,46(11).
[5]Cabral W A, Makareeva E, Colige A, et al. Mutations near amino end of α1 (I) collagen cause combined osteogenesis imperfecta/Ehlers-Danlos syndrome by interference with N-propeptide processing[J]. Journal of Biological Chemistry, 2005, 280(19): 19259-19269.
[6]Rauch, F., et al., Genotype-phenotype correlations in nonlethal osteogenesis imperfecta caused by mutations in the helical domain of collagen type I[J]. Eur J Hum Genet, 2010,18(6): 642-647.编辑/哈涛