H5N1亚型禽流感病毒在MDCK细胞中增殖条件的研究

孙德君等

摘 要：目的：探索H5N1亚型禽流感病毒在MDCK中增殖规律，确定最佳增殖条件。方法 将H5N1亚型禽流感病毒接种到6孔板培养的MDCK细胞进行增殖试验，检测不同病毒感染量、不同浓度TPCK-胰酶，接毒后不同时间病毒的HA滴度。根据确定的最佳增殖条件将病毒接种到微载体培养的MDCK细胞中进行大规模增殖。结果：最佳病毒增殖条件接毒量MOI为5×10-4、TPCK-胰酶浓度为4 μg/mL，在5 L 生物反应器中重复验证，获得稳定的试验结果，病毒血凝价最高为8 log2。结论：本研究为禽流感疫苗的生物反应器规模化生产奠定了基础。

关键词：H5N1亚型禽流感病毒；MDCK细胞；规模化培养

Abstract： To explore the regularity for the multiplication of avian influenza virus subtype H5N1 in MDCK cell culture system and determine the optimal proliferation conditions. H5N1 subtype of avian influenza virus was inoculated into the MDCK cell growing on 6 well plate， and the HA titers of virus at different time were detected in the conditions of different infectious doses， and different concentrations of TPCK-trypsin. The optimal conditions were determined. Then the H5N1 subtype avian influenza virus was grown in microcarrier-based MDCK cell. It was demonstrated that high virus yield with a hemagglutination unit of 8 log2（1∶256） could be obtained under the optimal conditions of multiplication. The result indicated the H5N1 subtype avian influenza virus could be produced in microcarrier-based MDCK cell in a large-scale culture system with a high virus yield and demonstrates the feasibility of the development of mammalian cell-based in influenza vaccine in microcarrier culture systems.

Keywords： H5N1 subtype avian influenza；Madin-Darbin canine kidney （MDCK） cell； large-scale culture

从首次发现禽流感病毒至今，世界上很多国家都大规模爆发过禽流感疫情，给养禽业带来巨大损失。我国是禽流感病毒高爆发区，农业部要求对鸡、鸭、鹅等家禽实施强制免疫，这就需要大量高效、安全、低成本的禽流感疫苗。目前市场上大部分疫苗仍为鸡胚制备，这种疫苗生产需要消耗大量的SPF鸡胚，且劳动强度大、生产周期长、产量不稳定，不利于应对大规模的禽流感疫情爆发。与传统鸡胚生产方法相比，动物细胞培养生产禽流感方法具有很多优势，如抗原匹配性好，可以进行大规模生产和缩短生产周期，自动化控制，减少过敏反应等。研究证明，禽流感病毒在犬肾传代细胞（MDCK）上具有良好的适应性，用其培养禽流感病毒获得的病毒滴度较高。实验中对H5N1亚型禽流感病毒在MDCK细胞中的增殖条件进行探索，以期筛选规模化培养流感病毒的最适条件，为建立新型流感疫苗的生产基质奠定基础。

1材料与方法

1.1 细胞和病毒

禽流感H5N1亚型病毒株购自哈尔滨兽医研究所，血凝价为9 log2（1∶512）；MDCK细胞系由北京清大天一科技有限公司提供。

1.2 主要试剂

培养基DMEM和胰酶购自GIBCO公司；国产新生牛血清购自济南劲牛生物材料有限公司；TPCK-胰酶购自Sigma公司；微载体Cytodex-1购自GE公司；1%鸡红细胞悬液有作者实验室制备。

1.3方法

1.3.1 禽流感病毒在细胞6孔板中增殖培养

1.3.1.1 病毒感染复数的确定

取长成单层MDCK细胞的6孔板，以不含血清的DMEM培养液洗涤3次，将禽流感病毒以不同的MOI（1×10-3、5×10-4、1×10-4、5×10-5）分别接种于MDCK细胞，加入TPCK-胰酶浓度为2 μg/mL的病毒维持液继续培养。每隔12 h取细胞上清，按照微量红细胞凝集试验检测病毒的HA滴度。

1.3.1.2TPCK-胰酶浓度的确定

按照1.3.1.1中的步骤将病毒以MOI为5×10-4接种于MDCK细胞，分别加入TPCK-胰酶浓度为0、2、4、6和8 μg/mL的病毒维持液继续培养。每隔12 h取细胞上清，按照微量红细胞凝集试验检测病毒的HA滴度。

1.3.2 禽流感病毒在生物反应器中增殖培养

根据6孔板中摸索的病毒培养条件，在5 L反应器中验证MDCK细胞的微载体培养工艺的可行性。微载体用量为4 g/L，细胞接种密度为4×105 cells/mL，细胞在微载体上培养72 h后，弃去培养液，按MOI为5×10-4将病毒液加入微载体细胞悬液中，补加TPCK-胰酶浓度为4 μg/mL的病毒维持液。每12 h取样，观察微载体上细胞吸附和生长情况，并用微量红细胞凝集试验检测病毒的HA滴度。

2 结果

2.1 禽流感病毒在细胞6孔板中增殖培养

2.1.1 感染复数对禽流感病毒增值的影响

当接种病毒的MOI为5×10-5时，由于病毒感染量低而使增值速度降低，无法达到较高的血凝价。当接种病毒的MOI大于1×10-4时，病毒均可以大量增殖，其中MOI为5×10-4时，病毒的HA滴度较高，最高值为8 log2，结果见表1。

2.1.2 TPCK-胰酶浓度对禽流感病毒增值的影响

MDCK细胞接种禽流感病毒后，随TPCK-胰酶浓度的增高，可明显提高细胞增殖病毒的血凝效价；但TPCK-胰酶浓度过高，由于发生细胞脱落，病毒HA血凝滴度逐渐降低。当TPCK-胰酶浓度为4 μg/mL时，病毒HA滴度在接毒后48 h达到最高值9 log2。结果见表2。

2.2禽流感病毒株的规模化培养结果

在反应器中采用微载体进行禽流感病毒扩大培养，每12 h从反应器中取样观察并进行细胞计数，结果如图2所示。结果显示：接毒前细胞呈致密状，细胞明亮，培养基中漂浮的游离细胞少，没有细胞碎片存在。细胞计数结果显示到达72 h时微载体上细胞已长成致密单层，细胞计数结果为3.5×106 cells/mL。接种禽流感病毒 24 h后，开始出现细胞病变，主要变现为细胞逐渐从微载体表面脱落下来，随着培养时间的延长，脱落细胞增多，病毒维持液略显混浊，48 h后绝大多数细胞从微载体上脱落，而且形态发生改变，同时大部分的微载体颗粒变成空球。由表3可知，病毒HA滴度在接毒后48 h即达到最高值，最高值为8 log2。

3 讨论

利用动物细胞生产禽流感疫苗，可以在短期内大规模增殖病毒，在疫情爆发时提供足够的疫苗产品的，还降低了由于病毒在鸡胚中连续传代而引起基因发生突变的概率，使免疫效果更为可靠。MDCK细胞生产疫苗的生物安全性已经得到各国的广泛认可。

本试验中禽流感病毒接种MDCK细胞，在胰酶作用下进行循环增殖，适当的病毒接种量，可以很好的实现病毒增殖。当病毒接种量过多时，细胞在病毒感染下很快死亡，同时还可能会产生干扰缺损病毒，限制病毒的多循环感染[1]；当病毒接种过少时，病毒要经过多次循环复制，达到血凝滴度峰值的时间延长，病毒生产过程减慢。

胰酶可使不具感染性的非裂解型血凝素变为有感染性的血凝素，从而促进病毒在细胞中的增殖。细胞维持液中不含有蛋白水解酶，无法裂解病毒血凝素，因此要适当加入胰酶，来提高病毒滴度[2]。本实验中，随着胰酶浓度的增加，促进了病毒在细胞间的循环感染，病毒滴度逐渐升高。但当胰酶浓度含量超过4 μg/mL时，病毒的滴度有下降的趋势，可能是由于胰酶对病毒有一定的破坏，也有可能是胰酶浓度过高对细胞有一定的损伤作用。

动物细胞培养中生物反应器规模化培养技术是日趋成熟的一种技术，已经用于多种疫苗的生产，如狂犬病疫苗[3]、蓝耳疫苗[4]、黄热病毒疫苗[5]等。国外疫苗生产企业的生物反应器规模化培养技术水平已经达到能够放大至6 t自动控制的规模，而国内生物反应器规模化培养技术应用于兽用疫苗才刚刚起步，培养工艺、培养规模远落后于国外。本试验对H5N1亚型禽流感病毒增殖的条件进行了研究，确定最佳病毒增殖条件是接毒量MOI为5×10-4、TPCK-胰酶浓度为4 μg/mL，在5 L生物反应器中重复验证，获得稳定的试验结果，病毒血凝价最高为8 log2。本研究为禽流感疫苗的生物反应器规模化生产奠定了基础。

（编辑：狄慧）

参考文献：

[1] Audsley JM， Tannock GA. The growth of attenuated influenza vaccine donor strains in continuous cell lines[J]. Journal of Virological Methods， 2005， 123（2）：187-193.

[2] 周伯平， 黎毅敏， 陆普选. 人禽流感[M]. 北京：科学出版社， 2007.

[3] ROUROU S， VAN DERARK A， MAJOUL S， et al. A novel animal-component-free medium for rabies virus production in Vero cells grown on Cytodex 1 microcarriers in a stirred bioreactor[J]. Appl Microbiol Biotechnol， 2009， 85（1） ：53-63.

[4] 冯 磊， 褚 轩， 吴培培. Marc-145 细胞微载体悬浮培养及 PRRSV 增殖工艺的[J]. 江苏农业学报， 2012， 28（3） ： 589-603.

[5] SOUZA M C， FREIRE M S， SCHULZE E A， et al. Production of yellow fever virus in microcarrier-based Vero cell cultures[J]. Vaccine， 2009， 27（46） ： 6420-6423.