平贝母愈伤组织的诱导及植株再生

孙雪等

摘 要：平贝母为一味传统中药，但其产量却受繁殖系数低等因素限制。因而为筛选出平贝母鳞茎再生的最佳离体培养体系，本文分别研究了外植体种类，激素的不同浓度和组合以及光照对愈伤组织诱导的影响和不定芽再生的影响。

关键词：平贝母 愈伤组织 不定芽

Callus Induction of Fritillaria ussuriensis and plant regeneration

SUN Xue XU Yuan Sun Chun yu Jiang Shi Cui Wang Kang Yu ZHANG Mei Ping WANG Yi

（Jilin Agricultural University，Changchun 130118，China）

Abstract：Fritillaria ussuriensis is traditional Chinese medicine，but its production has limitations of low propagation coefficient.To filter out the best regeneration system of Fritillaria bulbs in vitro culture.This paper studies the kinds of explants，hormones has different concentrations and combinations，and light have effect on callus induction and bud regeneration.

Key words：Fritillaria ussuriensis Maxim；Callus；Adventitious buds.

平贝母（Fritillaria ussuriensis Maxim）为我国中医学中常用的一味非常重要的药用植物。其味甘补肺，入药后能够止咳化痰抗炎，是祖国传统医学中非常重要的一味中药，因其良好的医疗效果，其市场需求量很大。但平贝母本身具有两次生长两次休眠的特性，因而生长缓慢，达到商业标准需要几年的时间。平贝母多生长在高寒地带，其繁殖系数低，田间管理费时费力，故而产量很低[1-2]。平贝母的快繁技术在提高其产量上起着非常重要的作用。目前在贝母属植物中关于暗紫贝母、浙贝母、平贝母、伊贝母、和川贝母[3-7]的快繁技术均有报道。本文分别以平贝母的顶芽、茎段、叶片为外植体，再分别添加相应浓度的2，4-D、BA、KT、NAA获得再生植株，又利用正交试验的方式进而确定愈伤组织的诱导体系和植株的再生体系。

1 材料和方法

1.1 实验材料

实验材料均取自吉林农业大学标本园种植的平贝母（2～4年生）3月中旬至4月中旬的顶芽、茎和叶片。

1.2 方法

1.2.1 外植体的处理：所有实验材料均用用酒精（70%）进行消毒，时间为30s，消毒后用无菌水进行冲洗3～5次（1～2min/次），再用升汞（0.1%）消毒8～10min后，用无菌水冲洗3-5次，1～2min/次。叶片切成规格为0.4～0.5cm2的块，茎、顶芽切成段规格为1cm的段。培养基为MS培养基，其成分为蔗糖3%，琼脂0.65%。

1.2.2 平贝母最优培养体系的建立

将处理好的平贝母茎段、叶片、顶芽，分别接种到准备好的MS固体培养基中，定期观察记录生长状况，并对愈伤组织及不定芽的诱导率进行统计。

植物生长调节物质对培养材料的影响：2，4-D、BA、NAA、KT四种生长调节物质进行不同浓度组合后，分别对培养材料进行处理，分析各物质对培养材料生长、分化的影响，以长势和生物量的水平来确立最适浓度和种类。

光照对培养物的影响：取黑暗、弱光、强光等三个光照条件，观察光对培养材料的影响。其中光强分别为1000Lx和2000Lx，光周期为16h/d。

1.2.3 试验统计方法：平贝母愈伤组织诱导率=诱导愈伤组织数/接种外植体数×100%；平贝母不定芽诱导率=形成芽的块数/外植体块数×100%；平贝母不定芽分化率=分化绿点的愈伤组织块数/接种愈伤组织块数×100%；平贝母鳞茎诱导率=形成鳞茎的愈伤组织块数/接种愈伤组织块数×100%。

2 实验结果

2.1 平贝母愈伤组织的诱导

2.1.1 外植体对平贝母愈伤组织诱导的影响

表1为不同外植体对平贝母愈伤组织的诱导效果，从表1中可以看出，平贝母不同种类外植体愈伤组织的诱导率差异较大。其中，诱导率最高的为茎段，达到77.5%，而叶片的诱导率为10%。

2.1.2 不同生长调节物质对愈伤组织诱导的影响

为了研究2，4-D、BA、KT和NAA四种生长调节物质的不同浓度配比后对愈伤组织诱导的影响，本文进行了L16（44）正交试验。各种生长调节物质的因素和水平均如表2所示，实验重复进行3次，每个实验的样本数大于30个。

表3为添加4种不同浓度激素后的正交实验方差与实验结果，从表中可知平贝母愈伤组织的诱导率因生长调节物质的浓度不同有差异，可以得出RA>RC>RD>RB，因而2，4-D是愈伤组织诱导过程中的主要影响因素。相比之下KT、NAA和BA对愈伤组织诱导率的影响较小。能够使愈伤组织诱导率达到最高的激素组合为A3、B4、C3、D1，即2，4-D浓度为2.5mg/L。

2.1.3 光照对平贝母愈伤组织的影响

表5为光照对培养材料的影响，从表中可以看出光照和黑暗条件下均能获得平贝母的愈伤组织。黑暗条件下平贝母愈伤组织的诱导率最高，并且愈伤组织呈黄色，较松散，脱分化速度较快；强光下平贝母愈伤组织的诱导率最低，愈伤组织呈浅绿色，质地密，脱分化速度慢。

2.2 平贝母器官发生的诱导

2.2.1 平贝母不定芽的诱导

表6为平贝母不同部位外植体不定芽的诱导效果。由表可以看出不同外植体不定芽诱导率差异较大。其中诱导率最高的为顶芽外植体，其诱导率为75%；茎段外植体的不定芽诱导率为60%；叶片的诱导率最低仅为12.5%。

2.2.2 植物激素种类和浓度对平贝母芽分化的影响

为了研究BA、NAA和2，4-D对平贝母不定芽诱导的影响，本实验采用L9（33）正交试验。各因素和水平均如表7所示，试验重复3次，每个实验的样本数大于30个。

表8表9为添加不同激素后正交试验方案与实验结果及方差数据。从表中可知三种激素对平贝母不定芽诱导率产生影响的主次顺序为NAA>BA>2，4-D，也可得出NAA0.5mg/L、BA 1.0mg/L的组合是诱导不定芽产生的最佳激素。

2.2.3 光照对不定芽分化增殖的影响

表10为光照对平贝母不定芽分化增殖的影响。由表中可以看出，在黑暗条件下，增殖系数最高的为不定芽。而在强光下不定芽的生长系数最高，但随着培养时间的延长，强光下的培养物中愈伤组织的部分会出现褐化现象。而弱光下的组织则生长状态良好。因而，黑暗条件有助于平贝母不定芽的增殖，而强光条件则会使不定芽生长、成苗的速度加快。

3 讨论

影响体胚的发生和发育的一个重要因素是植物离体培养的条件，而这个条件包括外部条（如培养基种类、光照与否、植物生长调节物质的浓度和种类）和内部条件（如外植体的取材部位和取材时间）。本实验研究结果表明，平贝母的茎段适宜诱导胚性愈伤组织，诱导率可达77.5%，而叶片的诱导率较低只有10%。这与袁艺[8]等报道的浙贝母叶片诱导愈伤组织的诱导率为10%～13.3%一致，这说明平贝母愈伤组织的诱导率与外植体取材部位有关。茎段的诱导率较高的原因可能是由于接种后茎段膨大、开裂，而愈伤组织较易在伤口处形成。叶片接种后虽也有膨大、和边缘卷曲现象，由于其分化程度较高，在接种后较难进入脱分化过程，因此只有较少部分在边缘长出黄色愈伤团。并且由于品种不同，培养条件也不同，因此实验结果也可能存在出现微小差异。

本实验研究结果还表明不管是强光还是弱光都在一定程度上抑制了愈伤组织的产生和生长，这可能与光照条件下植物组织会在不同程度上形成已分化状态的维管组织有关。实验中由不同外植体直接诱导不定芽时发现，顶芽的诱导效率最高为75%，这个结果高于茎段和叶片的诱导率60%和12.5%，这与王跃华（2010）等的川贝母叶片的鳞茎诱导率32%不完全一致，出现这样的结果可能与顶芽属于植物的顶端分生组织，生长活跃，顶芽内的激素的种类和水平与茎段和叶片内的都不同有关。在植物组培过程中，外源激素必须通过外植体中的内源激素发挥作用[9]。而本实验中不定芽诱导过程中顶芽的诱导效率最高，这可能是由于顶芽中的内源激素和培养基中添加的外源激素共同作用后，促使激素水平更有利于不定芽的产生。

参考文献

[1] 朱四易.中国贝母属植物研究[M].西安：西北大学出版社，1995.

[2] 王文杰.贝母[M].北京：中国医药科技出版社，1990.

[3] 高山林，朱丹妮，蔡朝晖.暗紫贝母鳞茎器官营养生长特征和生物碱积累研究.中国药科大学学报，1992，23（3）：144.

[4] 苏新，赵岚.浙贝母鳞茎的定向组培（简报）.植物生理学通讯，1990，26（5）：19.

[5] 周宝钧.平贝母鳞茎组织培养的研究.植物生理学通讯，1983，19（1）：30.

[6] 郝玉蓉，李明世，吴跃武.伊贝母愈伤组织诱导和植株再生的研究.西北植物研究，1982，2（l）：38.

[7] 王跃华，闫胜杰，代勇，等.川贝母不同部位外植体对鳞茎再生的影响.南农业学报，2010，23（6）：20-29.

[8] 袁艺，林宏辉，王万军，等.浙贝母鳞茎愈伤组织的诱导及植株再生.西南交通大学学报，2005，40（2）：281-284.

[9] 颜吕敬.植物组织培养手册[M].上海：上海科学技术出版社，1990.