固相微萃取与气相色谱—质谱联用测定肉产品中的克伦特罗

江勇 胡贵祥 朱惠芳

摘 要：建立了固相微萃取与气相色谱-质谱联用测定肉中克伦特罗的方法。在一定线性范围内，本方法相关系数0.9993，回收率96%～104%，检出限0.48 μg /kg，相对标准偏差7.1%。方法快速、准确，具有良好的实际应用价值。

关键词：固相微萃取；气质联用；克伦特罗；肉

Using gas chromatography –mass spectra coupled with solid phase microextraction to

determine clenbuterol in meat

JIANG Yong1， HU Gui-xiang2， ZHU Hui-fang2

（1.School of Life Science， Jiangxi Science and Technology Normal University， Nanchang 330013， China；

2. Nanchang Center for Disease Control and Prevention， Nanchang 330038， China）

Abstract： A method was developed for determination of clenbuterol in meat with gas chromatography –mass spectra coupled with solid phase microextraction. The correlation coefficient was 0.9993， and the recovery were between 96%～104% with relative standard deviations of 7.1%. The detection limits was 0.48 μg /kg. The analytical procedure required simple operation and provided accurate and reliable results. The method could be applied in real works.

Keywords： solid phase microextraction； gas chromatography –mass spectra； clenbuterol； meat

中图分类号：TS251.1 文献标志码：A

克伦特罗（Clenbuterol），俗称“瘦肉精”[1-2]，具有松弛支气管平滑肌的作用，常用于治疗哮喘，为强效选择性β2-受体激动剂。克伦特罗能够改变动物体内的脂肪分布，增加瘦肉率，90年代以来，克伦特罗广泛应用于饲料添加剂中，引起了大量“瘦肉精”食物中毒事件。如今克伦特罗已被世界上大多数国家在畜牧养殖中禁止使用[3-5]。

检测肉产品中克伦特罗的方法很多，包括：液相色谱法[6]、液质联用法[7]、气质联用法[8-10]、酶联免疫法（euzymelinked immunosorbent assay，ELISA）[11]等。酶联免疫法假阳性较高，只能半定量，一般用于克伦特罗的快速检验和大批量样品的初筛实验。色谱法尤其是气质联用法和液质联用法，为国家标准规定的确证方法，但它们的样品前处理过程非常复杂，多采用固相萃取、液液萃取以及分子印迹[12]等技术，采用气质联用对克伦特罗进行检测，还需要对克伦特罗衍生化。这些方法检测成本高、试剂消耗量大、操作时间长。

1990年，Pawliszyn等[13]提出了集采样、萃取、浓缩、进样于一体的固相微萃取（solid-phase microextraction，SPME）技术，无需溶剂，在水质、土壤、食品检测中得到了广泛应用。目前已有利用固相微萃取技术测定尿液及水中克伦特罗的报道。

本实验以肉产品为研究对象，研究固相微萃取结合气质联用检测肉制品中克伦特罗的方法。该方法为保证定性、定量结果的可靠性，同时采用了稳定性同位素稀释技术。克伦特罗的萃取和衍生均在固相微萃取纤维头的表面直接进行，缩短了分析时间，提高了分析的准确性和稳定性。

1材料与方法

1.1 材料与试剂

克伦特罗标准品、D9-克伦特罗标准品（100 ng/μL） 德国Dr.Ehrenstorfer GmbH公司；N，O-双-（三甲基硅氧基）三氟乙酰胺（BSTFA） 美国Supelco公司；盐酸、乙酸锌、氯化钠、亚铁氰化钾和氢氧化钠均为分析纯。分析用水均为高纯水。

1.2 仪器与设备

具有AOC5000自动进样器的GCMS-QP2010气质联用仪 日本岛津公司； 85 μm 聚丙烯酸酯萃取头（PA） 美国Supelco 公司；20mL顶空瓶 美国Alltech公司；磁性盖（含PTFE/蓝色硅胶20mm盖垫） 德国CNW Technologles Gmbh。

1.3 方法

1.3.1 样品前处理

准确称取10 g样品，然后加入20 mL 浓度为1 mol/L HCl溶液，同时加入150 μL 质量浓度为1 mg/L的D9-克伦特罗内标液。混合匀浆后，转移至50 mL容量瓶，用少量HCl溶液清洗2至3次，在容量瓶中加入5 mL 的10.6 % （w/v）的亚铁氰化钾溶液和5 mL 21.9 % （w/v）的乙酸锌溶液，用HCl溶液定容。过滤后，吸取10 mL滤液，加入顶空瓶中，滴加30 %的氢氧化钠，至溶液出现浑浊，然后又消失为止。继续加入4.5 g氯化钠，使溶液过饱和，用纯水定容至15 mL。在另一顶空瓶中加入100 μL衍生试剂，钳紧瓶盖后与样品顶空瓶一起放入自动SPME进样器中。

1.3.2 固相微萃取

选取PA纤维头，采用顶空方式自动萃取样品。固相微萃取条件为：振荡频率504 r/min，萃取温度90 ℃，萃取时间100 min。萃取完毕后，纤维头移至衍生试剂顶空瓶中，在优化条件下衍生。衍生完成后，直接进样，热解析6 min。然后重复进行下一个样品的萃取。

1.3.3 色谱条件

色谱柱：Rtx-5MS石英毛细柱（30 m×0.25 mm，0.25μm）；柱前压552 KPa；进样口温度260 ℃；程序升温：初温70 ℃，保持3 min，以18 ℃/min升至200 ℃，以58 ℃/min升至245 ℃，25℃/min升至280 ℃，保持2 min；解析时间6 min，不分流时间3 min；载气He（纯度99.999%）。

1.3.4 质谱条件

监测方式为选择离子（Selected ion mode，SIM）方式，离子源温度200 ℃，接口温度230 ℃，溶剂延迟14 min。克伦特罗衍生物的选择离子为定量离子m/z86，参考离子m/z187、243、262；内标物D9-克伦特罗衍生物的选择离子为定量离子m/z95，参考离子m/z196、252、262；以定量离子的峰面积内标法定量。

2结果与分析

2.1 固相微萃取条件

对相关文献[14]中固相微萃取法检测克伦特罗的条件进行改进，以适应自动固相微萃取的要求。改进后的条件为：振荡频率504 r/min，萃取温度90 ℃，萃取时间100 min。克伦特罗在碱性水溶液中为中等极性半挥发性化合物，适合采用85 μm PA纤维头进行固相微萃取。为保证溶液的碱性条件，用氢氧化钠调整，其最终的pH值约为14。在强碱性条件下，如果采用纤维头直接萃取方式，会影响纤维头寿命，因而本实验采取顶空方式进行萃取，以避免纤维头表面与强碱溶液的直接接触。

2.2 衍生条件的选择及优化

采用气质联用法测定克伦特罗，必须对克伦特罗进行衍生。常规衍生反应是将克伦特罗与BSTFA在密闭反应瓶内进行。反应时间长，容易受环境影响，，只要微量水分进入反应瓶，就能引起衍生化反应的失败。

本实验利用自动固相微萃取装置，将SPME纤维头自动插入充满BSTFA蒸汽的顶空瓶中直接衍生。这种在线衍生技术的实现，使得BSTFA蒸汽直接和SPME纤维头表面吸附的克伦特罗接触。由于气体扩散速度快，因而衍生反应时间可以大大减少。影响在线衍生的因素有衍生时间、衍生温度及顶空瓶的振荡频率，可以分别进行优化。

将30 μL克伦特罗标准液加入顶空瓶中，同时加入4.5 g氯化钠，纯水定容至15 mL，氢氧化钠调pH至14。SPME条件为：萃取温度70 ℃，萃取时间60 min，振荡频率500 r/min。SPME结束后，纤维头自动进入含100 μL BSTFA的顶空瓶中，优化衍生温度、衍生时间和振荡频率对衍生效率的影响。

2.2.1 振荡频率对衍生效率的影响

图1 振荡频率对衍生效率的影响。

Fig.1 Effect of Agitation speed on the derivation efficiency.

在衍生时间20 min，衍生温度70 ℃条件下，考察振荡频率对衍生效率的影响。振荡频率能够影响衍生试剂在顶空瓶中的挥发及在纤维头表面的扩散速度，同时也影响了衍生产物从纤维头表面扩散到顶空瓶的速度，因而振荡频率对衍生效率的影响有一个最佳值。由图1可知，随着振荡频率的增加，响应值先升高，再降低，响应最高的振荡频率为500 r/min。

2.2.2 衍生时间对衍生效率的影响

图2 衍生时间对衍生效率的影响。

Fig.2 Effect of derivation time on the derivation efficiency.

在衍生温度为70 ℃，振荡频率为500 r/min条件下考察衍生时间对衍生效率的影响。由图2可知，衍生时间的增加提高了克伦特罗衍生效率。最优衍生时间为20 min。20 min后衍生效率随着时间的增加虽有提高，但变化很小。

2.2.3 衍生温度对衍生效率的影响

图3 衍生温度对衍生效率的影响。

Fig.3 Effect of derivation temperature on the derivation efficiency.

在振荡频率500 r/min、衍生时间20 min的条件下，考察衍生温度下对衍生效率的影响。由图3 可知，克伦特罗衍生物在色谱图上的响应值随着温度升高而增大，80 ℃时最高，然后缓慢降低，从85～90 ℃，响应值急剧下降。由此可知衍生温度对衍生效率影响较大。最优衍生温度为80 ℃。

综上可知，最优衍生条件为衍生振荡频率500 r/min，衍生温度80 ℃，衍生时间20 min，。

2.3 线性和最低检出限

在阴性样品中准确添加克伦特罗标准溶液，使其最终含量分别为 2.5、12.5、50、75、150、250 μg/kg，按1.3节进行样品前处理及SPME，并按优化后的条件在线衍生，用气质联用仪测定，考察其线性。克伦特罗的含量（y）和克伦特罗与内标峰面积的比值（x）之间线性关系良好，线性方程为y=79.79x―4.15，相关系数r2 = 0.9993，最低检出限0.48 μg/kg（RSN=3），最小定量检出限1.59 μg/kg（RSN=10）。

2.4精密度与回收率

按上述条件平行测定6个阳性样品，相对标准偏差（RSD）为7.1%。

在样品中添加克伦特罗标准溶液，加标浓度分别为2.5、75、150 μg/ kg，按本文条件每个样品平行测定3次，所得结果见表1。平均回收率为96%～104%。图4为加标样品选择离子色谱图，克伦特罗和D9-克伦特罗峰形尖锐、对称，响应较好。

图4 加标样品中克伦特罗衍生物和D9-克伦特罗衍生物的选择离子色谱图

Fig.4 Chromatogram of clenbuterol BSTFA derivative and D9-clenbuterol BSTFA derivativselected ions in

spiked samples

3 结 论

本实验采用自动固相微萃取结合气质联用法对肉产品中的克伦特罗进行了检测，方法快速、准确，检测时间由国标方法的8 h缩短至2 h，实现了检测过程的自动化。检测过程中不需要有机试剂，因而消除了有机试剂对环境的污染，降低了检测成本，具有很好的实际应用价值。

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