鸡堆型艾美耳球虫孢子化卵囊cDNA文库的免疫学筛选

阎晓菲等

摘要[目的] 寻找鸡球虫保护性抗原基因，为研究基因功能和研制抗鸡球虫疫苗奠定基础。[方法] 将纯化的堆型艾美耳球虫孢子化卵囊于兔皮内多点注射，制备堆型艾美耳球虫抗血清，用间接酶联免疫吸附试验（ELISA）检测其效价，进行免疫学筛选。利用PCR对获得的阳性克隆进行初步鉴定。[结果] 间接酶联免疫吸附试验结果表明堆型艾美耳球虫抗血清检测结果呈阳性，初步筛选到的疑似阳性斑经3次复筛后获得6个阳性克隆，1～3号克隆约为1 000 bp，4～6号克隆约为1 500 bp。[结论]对堆型艾美耳球虫孢子化卵囊cDNA文库获得的阳性克隆成功进行了免疫学筛选。

关键词鸡；球虫；堆型艾美耳球虫；cDNA文库；免疫学筛选

中图分类号S821文献标识码A文章编号0517-6611（2014）14-04363-02

Immunological Screening of cDNA Expression Libraries in Sporulated Oocysts of Eimeria acervulina

YAN Xiaofei et al（Science and Technology School of Xinjiang Agricultural University， Xinjiang， Urumqi 830052）

Abstract[Objective] The research aimed to find out the protective antigen gene of chicken coccidian and lay the foundation for studying the gene function and producing vaccine against chicken coccidiosis. [Method] The purified sporulated oocysts of Eimeria acervulina was injected in many points of rabbit skins to prepare the antiserum of E. acervulina. And its titer was detected by ELISA to make immunological screening. And the obtained positive clone was identified by PCR. [Result] The results of ELISA showed that the antiserum detection results of E. acervulina was positive. After preliminary screening， suspected positive plaques were obtained， then 6 positive clones were obtained after three times of second screening. The size of 1-3 clone were about 1 000 bp and that of 4-6 clone were about 1 500 bp. [Conclusion] The immunological screening of the positive clones obtained from cDNA library of sporulated oocysts of E. acervulina was made.

Key wordsChicken； Coccidia； Eimeria acervulina； cDNA library； Immunological screening

鸡球虫病是由艾美耳球虫寄生于鸡肠道所引起的一种危害极其严重的全球性寄生虫病，每年给养鸡业造成巨大的经济损失。鉴于鸡球虫病的严重危害，如何对其有效预防成为广大生产者及科研工作者广为关注的问题。目前防治鸡球虫病主要有2种方法：药物预防和疫苗预防。由于药物防治球虫病存在严重的抗药性、且药物的研制周期长、费用高以及药物残留造成的环境污染等问题的存在，对鸡球虫病的防治越来越趋向于疫苗防治。活卵囊疫苗虽然已经在国外上市，但由于免疫效果和安全性问题，并未得到广泛推广使用，因此必须采取新的措施防制鸡球虫病[1]。目前，应用现代生物技术构建的基因工程疫苗已被证实可以诱导宿主产生长期的体液免疫和细胞免疫，抵抗包括球虫病在内的多种疾病，因此成为疫苗发展的新方向[2]。

目前已克隆出一些鸡球虫保护性抗原基因，主要是通过构建表达性DNA文库或cDNA文库，再用各种抗体或探针筛选保护性抗原基因。从cDNA表达文库中筛选目的基因的方法较多，其中以抗血清为探针筛选目的克隆是获取未知基因灵敏可靠的方法。构建于表达载体中的cDNA文库可利用特异性抗体进行筛选，即将含文库的各培养皿上的菌斑转印到硝酸纤维素膜上，各种cDNA表达的蛋白质便牢固地结合在膜上，然后将膜放入特异性抗体的溶液中进行免疫结合反应，洗掉未结合的抗体后，再与HRP标记的第2抗体结合，通过相应底物显色，进而找出对应于原文库培养皿中的菌落，筛选出目的cDNA克隆[3-5]。笔者对建立的鸡堆型艾美耳球虫（Eimeria acervulina）孢子化卵囊cDNA文库进行免疫学筛选，以寻找保护性抗原基因，为研究基因功能和研制抗球虫疫苗奠定基础。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物。新西兰大白兔，健康，雄性，体重约2 kg，购自上海松联实验动物场。

1.1.2主要试剂。E.acervulina cDNA文庫由上海兽医研究所农业部动物寄生虫学重点实验室提供。该文库构建于λTriplEx2噬菌体XL1blue大肠杆菌系统中，基础库容量为4.7×106 pfu/ml，扩增后文库的滴度为4.4×1010 pfu/ml；XL1blue、BM25.8大肠杆菌、引物：5′端引物：5′TCCGAGATCTGGACGAGC3′；3′端引物：5′TAATACGACTCACTATAGGG3′，由SMARTTM cDNA Library Construction Kit附带，购自Clontech公司。

1.1.3主要仪器。电热恒温水浴锅，由上海一恒科技有限公司生产，型号DK80；隔水式电热培养箱，由上海博迅实业有限公司医疗设备厂生产，型号GSP9050MEB；托盘天平，由上海医疗器械八厂生产，型号BPⅡ；超声破碎仪、核酸蛋白测定仪，由德国Eppendorf公司生产。

1.2方法

1.2.1E.acervulina抗血清的制备。用pH7.6 PBS将纯化的E.acervulina孢子化卵囊调整到2×107个/ml，于-70和38 ℃下反复冻融5次，冰浴条件超声裂解卵囊20 min，10 000 r/min离心30 min，收集上清液作为E.acervulina可溶性抗原。用弗氏完全佐剂和E.acervulina可溶性抗原按1∶1的比例完全乳化，于兔皮内多点注射，进行一免，蛋白剂量共为3 mg；2周后二免，剂量为共3.5 mg，佐剂为弗氏不完全佐剂，皮内注射；二免后2周进行三免，直接皮内注射E.acervulina可溶性抗原8 mg。三免2周后采血，按照常规方法分离血清，将收集到的血清-20 ℃下冻存备用。

1.2.2E.acervulina cDNA文库的免疫学筛选。用间接酶联免疫吸附试验（ELISA）检测E.acervulina抗血清的效价。利用大肠杆菌裂解液对抗血清进行预吸收，以去除大肠杆菌抗体。免疫学筛选方法参考有关文献[6-7]并作适当修改。取1.5 ml无菌离心管，加入2 μl 1∶10 000稀释的cDNA文库（每块90 mm的平板所形成的噬菌斑≤600）及200 μl细菌（XL1blue菌）悬液，37 ℃下孵育20 min。加入10 ml已融的顶层琼脂，铺于预热至37 ℃的含四环素的LB琼脂平板上，37 ℃倒置培养4～6 h。覆盖经10 mmol/L IPTG浸泡并已凉干的NC膜，继续倒置培养3 h。取出NC膜，置于己经预吸收的抗血清中，用PBST漂洗，DAB底物显色，阳性反应斑为棕色圆形中空斑。初筛阳性克隆经适当稀释后再复筛3次，直至NC膜上全部斑点均为阳性反应。

1.2.3阳性克隆的初步鉴定。从3次复筛得到的阳性克隆中挑取单个嗜菌斑，加入500 μl 1×λ稀释缓冲液，混匀后4 ℃洗脱过夜。取5 μl洗脱液进行PCR鉴定，PCR反应条件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，35个循环；72 ℃延伸10 min；4 ℃下保存。PCR反应产物5 μl于1%琼脂糖凝胶100 V电泳30 min，凝胶成像仪拍照并存盘。

2结果与分析

2.1间接酶联免疫吸附试验（ELISA）检测抗体选用比率表示法判定ELISA试验结果，该方法是用测定样品的酶标孔（P）与阴性样品的酶标孔（N）平均吸收值的比值（P/N）表示。当P/N≥2.1，为阳性；若P/N<2.1，为阴性。堆型艾美耳球虫抗血清经ELISA检测，结果发现P/N为13.068，因此确定E.acervulina抗血清为阳性（如表1所示）。

3讨论

笔者采用E.acervulina可溶性抗原免疫兔子，获得E.acervulina抗血清，该血清中可能含有大肠杆菌抗体，为减少或消除免疫学筛选过程中造成的假阳性结果，必须对所用的血清先去除大肠杆菌抗体。通常去除大肠杆菌抗体的方法有假筛选法、大肠杆菌裂解液吸收法以及亲和层析法。笔者对去除大肠杆菌抗体的方法进行了一些改进，即用硝酸纤维素膜裁剪后，浸泡于大肠杆菌裂解液中，烘干后用封闭液4 ℃封闭过夜，再置于经适当稀释的抗血清中浸泡过夜。该方法尽量保持了抗血清中抗体的量和活性，一次性吸收较完全，试验操作简单、省时，无需其他特殊试剂，且节省了材料，增加了阳性克隆的机率。

利用E.acervulina阳性血清对cDNA表达文库进行筛选，将初步筛选到的疑似阳性斑重复筛选3次后，疑似阳性斑仍呈阳性，表明该重组阳性克隆嗜菌体株可以较稳定地表达堆型艾美耳球虫特异性抗原蛋白成分。采用PCR技术鉴定3次筛选后的阳性克隆是一种十分简便而有效的方法[8]。采用PCR方法初步鉴定了6个阳性克隆，插人片段大小为1 000～1 500 bp。

Christensen[9-10]报道在同一宿主体内寄生的不同种寄生虫之间存在生物学上的拮抗或协同作用，而近缘种间的拮抗性可能是由于这些寄生虫之间存在共同抗原。研究这些共同抗原的组分对于相关寄生虫病的免疫诊断和免疫预防具有重要意义。免疫预防是控制和消灭鸡球虫病的有效途径之一，目前很多疫苗分子是应用免疫学方法从鸡球虫cDNA文库中筛选出来的。Jenkins[11]等以E.acervulina子孢子和裂殖子为材料构建的cDNA文库中获得2个表达表面抗原的克隆，其编码的蛋白质通过125I标记、免疫印迹法、免疫荧光法和T细胞激活试验来识别。这2个克隆，1个命名为cSZ1，为分子量130 kD的β半乳糖苷酶（βgalactosidase）融合蛋白，应用抗cSZ1血清对活的或1%多聚甲醛固定的堆型艾美耳球虫子孢子进行的免疫荧光试验已经确认这种蛋白在子孢子表面的位置，但这种蛋白不能被感染E.acervulina的鸡血清所识别，也不能在体外激活T淋巴细胞；另1个克隆命名为cMZ8，为分子量250 kD的裂殖子抗原，应用抗cMZ8血清对125I标记的裂殖子蛋白进行免疫印迹试验，对活的及1%多聚甲醛固定的堆型艾美耳球虫裂殖子进行免疫荧光染色，可以证实纯化的cMZ8蛋白能被感染E.acervulina的鸡血清所识别，并且具有在体外诱导免疫T淋巴细胞的显著活性。鸡球虫基因工程疫苗研究自20世紀80年代开展以来，到目前为止仍未找到理想的候选分子，因此继续寻找候选分子仍然是鸡球虫基因工程疫苗研制中最为关键的一环。该试验筛选出的阳性克隆，为继续寻找鸡球虫疫苗提供了新选择。

参考文献

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