中西药联用对禽源大肠杆菌的体外抑菌效果研究

昌莉丽 李华坤 刘桂兰

摘要 [目的] 探讨中西药联用对禽源大肠杆菌的体外抑菌效果。[方法]采用微量肉汤稀释法测定2种临床常用西药（氟苯尼考、恩诺沙星）和4味中药（黄连、黄芩、金银花和板蓝根）对大肠杆菌多重耐药菌株的MIC值，探讨2种西药和4味中药联用对禽源大肠杆菌多重耐药菌株的体外抑菌活性。[结果]6种药物对大肠杆菌标准菌株和多重耐药菌株均具有抑菌活性。在8种中西药联用药物组合中，氟苯尼考/黄芩、恩诺沙星/黄连、恩诺沙星/黄芩3组药物组合联用具有相加作用，其他5组中西药物组合均呈现无关作用。[结论] 该研究可为进一步筛选有效药物组合防治禽大肠杆菌病提供重要指导。

关键词 禽源大肠杆菌；中西药联用；MIC

中图分类号 S852.61+8 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2014）16-05037-02

禽大肠杆菌病是养禽生产中最常见的疾病之一，只要饲养环境、气候和营养等稍有变化，大肠杆菌病就容易流行，并常常和其他疾病，尤其是与禽流感并发混合感染。然而，由于大肠杆菌的血清型复杂，无法用疫苗进行有效预防，临床上只能依靠抗菌药物来防治该病，在大量使用抗菌药物的同时，也带来了一系列问题，如耐药性增加、药物残留等。另外，作为我国传统资源的中药来源广、价格便宜，不仅具有抗菌消炎的作用，而且不易产生耐药性和药物残留，但是因为用量大、起效慢、疗程长等缺点，在临床应用十分受限。因此，将中西药结合起来防治禽源大肠杆菌病已成为解决目前防治大肠杆菌病难题的重要途径之一。基于此，笔者选择多重耐药菌株作为测试菌株，考察氟苯尼考、恩诺沙星与黄连、黄芩、金银花、板蓝根4味中药联用对禽源大肠杆菌多重耐药菌株病的体外抑菌活性，以期为进一步筛选有效药物组合防治该地区禽大肠杆菌病提供重要指导。

1 材料与方法

1.1 材料 中药黄芩、黄芪、柴胡、金银花、板蓝根；抗菌药氟苯尼考、恩诺沙星，均由瑞普天津生物技术有限公司研发部检验合格后馈赠。

药敏质控菌株ATCC25922，购于中国兽药监察所。临床分离株来源于徐州市兽医站畜禽门诊部，经剖检初步诊断为大肠杆菌，摘取病死鸡的肝、脾、输卵管等部位，在麦康凯培养基上培养分离，对分离菌株经革兰氏染色进行形态学观察和生化反应检查，鉴定为大肠杆菌，在普通琼脂斜面培养基上进行纯培养，胶塞密封保存，于4 ℃冰箱中保存备用。

M.H肉汤培养基、96孔U型板、营养琼脂培养基，均由杭州微生物试剂有限公司生产。

1.2 方法

1.2.1 药液制备。

1.2.1.1 中药药液的制备。主要采取水提法，分别称取黄连、黄芩、金银花、板蓝根5味药材100 g，加入蒸馏水500 ml，浸泡2 h后，煮沸30 min，改文火煮1 h，纱布过滤，药渣加水250 ml 继续煮沸30 min，过滤，合并2次滤液，加热浓缩至100 ml，最终获得药液含原药材1 g/ml，置4 ℃冰箱保存。

1.2.1.2 抗菌药药液的制备。精密称取定氟苯尼考和恩诺沙星于容量瓶中，加入适量助溶剂溶解后，加入PBS液，最终制成浓度为1.28 mg/ml的药液，微孔滤膜过滤后于4 ℃冰箱内保存备用。

1.2.2 菌液制备。所选用的大肠杆菌为徐州生物工程职业技术学院实验室分离并鉴定，采用K.B纸片法药敏试验筛选的多重耐药菌株，营养琼脂斜面培养基保存，取斜面上大肠杆菌菌落置于营养肉汤中培养18 h，划线接种于琼脂平板上，37 ℃培养18 h，挑取单个菌落置于10 ml MH肉汤中培养18 h，配好后于4 ℃冰箱中保存。采用平板稀释菌落计数法计算菌液含量，临用前用灭菌肉汤稀释成105 CFU/ml。

1.2.3 单药MIC值的测定。采用微量肉汤稀释法[1]测定4味中药和2种抗菌药对临床分离大肠杆菌多重耐药菌株的抑菌强度。取无菌96孔U型板，首先从第1孔到第12孔依次加入100 μl的菌液，第2步在第1孔加入100 μl的药液，混合后吸取100 μl混合液至第2孔，再次混合，依此类推至第11孔，移取100 μl，弃去不用，第12孔作为菌液对照，微量震荡器上振荡1 min后，37 ℃恒温箱中培养16～18 h后观察，以肉眼未见细菌生长的最低浓度为最低抑菌浓度。

1.2.4 中西药联用FIC值的测定。 采用微量肉汤棋盘稀释法[1]测定4种中药与2种抗菌药物联合的MIC值。取96孔U型板，以临床分离多重耐药菌株为测试菌株，每孔加入100 μl菌液，根据单药MIC值的测定结果，以2MICA为最高浓度，吸取50μl沿96孔板横轴依次倍比稀释到1/16 MICA，以2 MICB为最高浓度，沿96孔板纵轴依次倍比稀释1/16MICB，微量震荡器上振荡1 min，37 ℃恒温箱中培养18 h，测定2药联合时的MIC值。根据公式FIC值=（A药联合时的MIC值/A药单测时的MIC值）+（B药联合时的MIC值/B药单测时的MIC值）计算和判断中西药联合应用的效果。若FIC值<0.5，則表现为协同作用；若FIC值为0.5～1.0，则表现为相加作用；若FIC值为1.0～2.0，则为无关作用；若FIC值>2，则表现为拮抗作用。

2 结果分析

2.1 6种药物对大肠杆菌标准株和临床分离耐药菌株的MIC值 由表1可知，6种药物对大肠杆菌标准株和临床分离耐药菌株均有抑菌活性，其中4种清热解毒类中药抑菌活性以黄连MIC值最小（15.625 mg/ml），抑菌活性最高，其次为黄芩和金银花，板蓝根居后（125.000 mg/ml），其中4种中药对大肠杆菌的标准株和耐药菌株在MIC值上几乎无差异，说明中药对大肠杆菌标准株和耐药菌株的疗效无显著差异；2种抗菌药为目前临床常用的氟苯尼考和恩诺沙星，结果表明恩诺沙星对大肠杆菌耐药菌株的MIC值提高128倍，氟苯尼考对大肠杆菌耐药菌株MIC值提高16倍，说明试验菌株对2种抗菌药产生了较高的耐药性。

2.2 中西药联用对临床分离鸡大肠杆菌耐药菌株的FIC值 由表2可知，氟苯尼考/黄芩、恩诺沙星/黄芩、恩诺沙星/黄连药物3种药物组合呈现相加作用，联合用药后MIC值均较单独用药时有较大程度下降，尤其是恩诺沙星与黄芩、黄连联合用药后，其MIC值由原来单用时的0.080 mg/ml减少到联用后的0.010 mg/ml，抗菌活性提高了8倍。恩诺沙星/金银花、恩诺沙星/板蓝根、氟苯尼考/黄连、氟苯尼考/金银花、氟苯尼考/板蓝根5种药物组合表现为无关作用。

3 讨论

氟苯尼考、恩诺沙星是目前临床上（除头孢类抗生素）防治禽源大肠杆菌的主要抗菌药，关于大肠杆菌对头孢类抗生素耐药机制和联合用药报道较多，但对氟苯尼考、恩诺沙星的相关研究相对较少。耐药性调查[2]结果表明随着这2种药物在临床上的大量使用，大肠杆菌对氟苯尼考、恩诺沙星的耐药性逐年增加，2种药物的疗效已大大降低。该试验中将氟苯尼考、恩诺沙星分别与清热燥湿类中药黄连、黄芩，清热解毒类中药板蓝根、金银花联用，考察中西药结合对耐药大肠杆菌的抑菌活性，结果表明这6种药物均对大肠杆菌有抑菌作用，4种中药对大肠杆菌标准株和耐药株的抑菌活性无显著差异，说明与西药相比中药对大肠杆菌耐药菌株疗效相对稳定；在8对药物组合抑菌试验中，仅氟苯尼考/黄芩、恩诺沙星/黄芩、恩诺沙星/黄连3对药物组合表现相加作用，抑菌活性增强，其他均为无关作用。黄伟[3]报道氟苯尼考与黄芩联用内服给鸡用药，黄芩会加快氟苯尼考在体内的吸收速度，加速氟苯尼考在鸡体内的消除速度，说明氟苯尼考与黄芩联合用药后不仅疗效增加，而且起效快，药残减少，应为非常理想的药物组合。陈群等[4]以黄芩和黄连的提取物作为质粒消除剂，对大肠杆菌多重耐药菌株进行了体外R质粒消除试验，消除率达到22.57%，说明恩诺沙星与黄芩、黄连聯合用药后，不仅抑菌活性提高，还可以有效抑制大肠杆菌的耐药性。另外，中药成分复杂，作用机理不同于抗生素，疗效往往受中药各成分间的协同和综合作用影响，以西医基础为理论的体外抑菌活性试验仅能作为中西药联合作用的基础研究[5]，并不能完全代表药物体内疗效。该试验中表现无关作用的5对药物组合在临床实际用药中普遍存在，并且还取得好的临床疗效。罗智勇等[6]对双黄连配合氟苯尼考的临床疗效观察，发现该组合对猪支原体、鸡支原体、流感等均有较好疗效。总而言之，中医治病辨证施治，多用复方，中西药结合依靠药物间的协同作用通常可以增强抗菌效能，提高临床疗效。同时联合用药还可以防止和延缓耐药性的产生[7]。

参考文献

[1] 马绪荣，苏德模.药品微生物学检验手册[K].北京：科学出版社，2000.

[2] 昌莉丽，李华坤，朱广琴.2012-2014徐州地区禽源大肠杆菌耐药监测[J].湖北畜牧兽医，2014（3）：21-23.

[3] 黄伟.黄芩苷对氟苯尼考在健康鸡体内药动学影响的研究[D].雅安：四川农业大学，2013.

[4] 陈群，王胜春.黄芩和黄连对大肠杆菌R质粒消除作用的实验研究[J].广东医学院学报，1998，16（1/2）：1-3.

[5] 王新，崔一喆，韩铁锁，等.中西药联用体外抗菌活性的研究[J].黑龙江八一农垦大学学报，2009，21（4）：68-71.

[6] 罗智勇，谢波.双黄连配合氟苯尼考临床疗效观察[J].湖南畜牧兽医，2012（3）：7-8.

[7] 冯俊，张伟，宋存江.细菌内源质粒消除研究进展[J].微生物学报，2013，53（11）：1142-1148.安徽农业科学，Journal of Anhui Agri. Sci.2014，42（16）：5039-5041，5167

责任编辑 黄小燕 责任校对 李岩