食品和饲料中转基因植物FMV35S启动子环介导等温扩增检测方法的建立

邝筱珊 胡松楠 游淑珠等

摘要 [目的]建立FMV35S基因启动子环介导等温扩增的检测方法。[方法]建立一种检测食品和饲料中FMV35S转基因成分的环介导恒温扩增（LAMP）检测方法，并利用实时浊度法对该LAMP检测方法进行灵敏度、特异性和稳定性评价。[结果]该方法的检测限为0.5%，特异性和稳定性良好。采用LAMP法与荧光PCR方法进行了实际样品对比检测，结果一致可靠。[结论]可采用LAMP法对食品和饲料中FMV35S转基因成分进行检测。

关键词 食品；饲料；FMV35S基因；环介导恒温扩增；检测

中图分类号 S188 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2014）16-04999-03

截止到2012年，转基因作物的种植面积已经连续增长17年，达到了420 000 000 hm2[1]。新型转基因生物不断涌现的同时，有关转基因作物在食品安全性、环境保护和伦理方面的争论一直愈演愈烈。为了满足消费者的知情权和国际贸易的要求，越来越多的国家和地区要求对转基因食品进行标示。不同的国家和地区也相应的发布了检测方法和判定标准。我国也于2002年7月开始实施《转基因食品卫生管理条例》，对转基因食品产品进行标识管理。

荧光PCR法是经典的转基因检测方法，同时也是目前采用较多的一种检测方法。近年来，越来越多的人将目光投向了非PCR检测方法的研究，比如基于蛋白质的ELISA、免疫层析试纸条方法；还有基于核酸的荧光交叉相关光谱法[2]、基于生物条形码的电化学发光法[3]、基因芯片法[4]等。

环介导等温扩增（LAMP）是一种新的、非PCR的核酸检测方法[5]，最少可利用4条引物，在Bst DNA poLymerase作用下检测目的基因片段。LAMP反应有以下几个优点：不需要复杂的仪器装置，仅靠水浴锅或等温孵育装置即可达到反应要求；扩增产物肉眼可辨，不需要检测装置即可快速准确的判断；、LAMP检测反应时间短，1 h内可出具检测结果。基于以上优点，近些年LAMP已经广泛应用于病毒、食源性微生物、转基因和肉类鉴定方面[6-10]。

玄参花叶病毒35S启动子（Figwort Mosaic Virus promoter）FMV35S基因是植物遗传操作常用标记基因，很多转基因植物（如MON89034，RT73等）都含有FMV35S基因，是检测转基因生物的重要指标。笔者建立一种检测食品和饲料中FMV35S转基因成分的LAMP方法，为转基因的检测扩增提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 研究对象。豇豆、四季豆、大豆、玉米、花生、白云豆、豌豆、燕麦、荞麦、马铃薯、扁豆、番茄、核桃、大杏仁、绿豆、蚕豆、转基因油菜RT73、转基因水稻KMD、转基因小麦B73.6.1、转基因大豆DP305423、转基因大豆A5547.127、转基因大豆GTS40.3.2、转基因玉米MON89034、转基因玉米MIR604、转基因玉米EVENT98140、转基因玉米BT176和转基因玉米MON810，均由实验室提供。

1.1.2 主要仪器。PICO17高速台式离心机，购自Thermo Fisher Scientific公司；LA.320CLAMP实时浊度仪，购自日本荣研化学株式会社。

1.1.3 主要试剂。Bst DNA 聚合酶，购自New England Biolabs（NEB）公司；甜菜碱（Betaine）和MgCl2，购自Sigma公司；dNTPs，购自宝生物工程（大连）有限公司；SYBR Green I 荧光染料，购自厦门致善生物科技有限公司；LAMP引物，由生工生物工程（上海）有限公司合成；其他试剂均为国产分析纯，市售。

1.2 方法

1.2.1 基因组DNA 的提取。将样品置于粉碎机中均质碾磨成粉末状，植物样品基因组DNA提取采用CTAB法[11]。DNA提取完毕后，利用Thermo Fisher Nanodorp 测定核酸含量和质量。当OD260/OD280比值在1.7～1.9时，浓度50～100 ng/μl适宜于LAMP检测。

1.2.2 LAMP检测体系和反应条件。LAMP反应体系总体积为25 μl，其成分包括：FIP和BIP各1.6 μmol/L，F3和B3各0.2 μmol/L，20 mmol/L Tris.HCl（pH8.8），10 mmol/L KCl，8 mmol/L MgSO4，10 mmol/L （NH4）2SO4，0.1% Tween20，1 mol/L甜菜碱，1.6 mmol/L dNTP，8 U Bst大片断DNA聚合酶，2 μl DNA（50～100 ng/μl）。参照LAMP浊度仪使用说明，将混合物置于反应孔中，于63 ℃恒温反应60 min，最后于80 ℃下保温5 min以结束反应。

1.2.3 LAMP检测法检测FMV35S基因引物序列。通过GENEBANK下载FMV35S启动子序列，使用在线设计软件Primer Explorer version 4 （http：//primerexplorer.jp/e）和LAMP Designer软件设计特异引物FMV.4。

1.2.4 FMV35S基因LAMP检测法灵敏度试验。用均质的100%转基因玉米MON89034粉与均质非转基因大豆粉按比例配置成20%、10%、5%、1%、0.5%和0.1%（W/W）的标准样品，每个稀释度分别提取基因组DNA进行LAMP试验，以ddH2O代替DNA模板作为阴性对照，以FMV.4作为LAMP引物，100%转基因玉米MON89034作為阳性对照，63 ℃运行60 min以确定LAMP反应的灵敏度。

1.2.5 FMV35S基因LAMP检测法特异性试验。用转基因油菜RT73、豇豆、四季豆、大豆、玉米、花生、白云豆、豌豆、燕麦、荞麦、马铃薯、扁豆、番茄、核桃、大杏仁、绿豆、蚕豆、转基因水稻KMD、转基因小麦B73-6-1转基因大豆DP305423、A5547-127、GTS40-3-2、转基因玉米MON89034、MIR604、EVENT98140、BT176、MON810的DNA作为LAMP反应的模板，用FMV-4作为LAMP引物进行反应，63 ℃反应60 min，验证LAMP反应的特异性，利用LAMP浊度仪观察反应结果。

1.2.6 FMV35S基因LAMP檢测法稳定性试验。利用建立的LAMP检测法，分别对3个不同浓度（空白样品0%和添加水平0.5%、1%的MON89034阳性模拟样品）及MON89034标准品进行检测，每个样品重复20次，验证LAMP反应的稳定性，反应结束后向反应管加入SYBR Green I观察颜色变化，没有扩增产物的阴性管呈橙色，有扩增产物的阳性管为绿色。利用LAMP浊度仪和肉眼直接观察反应结果。

1.2.7 FMV35S基因LAMP检测法的应用。采用试验方法对市售的食品和饲料等20份样进行LAMP 检测。采用荧光 PCR法验证检测结果，荧光 PCR 检测所用引物探针参考检验检疫行业标准SN/T 1204-2003。

2 结果与分析

2.1 FMV35S基因LAMP检测法的特异性评价 以27种不同植物DNA作为LAMP反应的模板，用试验设计的FMV.4引物作为LAMP引物，进行LAMP检测。图1表明，FMV.4引物只对含有FMV35S启动子的模板（MON89034，转基因油菜RT73）特异性检出，对其他不含FMV35S启动子的转基因品系和非转基因物种均无扩增，未出现假阴性或假阳性结果，表现出良好的特异性。

2.2 LAMP灵敏度测定 图2表明，LAMP实时浊度法结果显示，不同浓度阳性模拟样品的出峰时间和样品浓度呈明显梯度变化，LAMP实时浊度法检测灵敏度可达0.5%。最低检出限0.5%出峰时间约41 min，可以将反应时间确定为60 min。

2.3 LAMP稳定性评价 采用以FMV4为引物，对3种不同浓度样品进行LAMP检测，每种样品重复20次。由表2可知，1%、0.5%及阴性样品稳定性试验结果与预期一致，显示该方法重复性和稳定性良好。

2.4 应用LAMP法检测食品中FMV35S转基因成分 对市售燕麦片、小麦粉玉米球和菜籽粕20份食品和饲料样品分别采用LAMP显色法和实时荧光PCR法进行对比检测。由表3可知，2种方法检测结果一致，表明可以采用LAMP法检测食品和饲料中FMV35S转基因成分。

3 结论与讨论

生物技术的不断发展使新转基因植物的种类在不断增加。围绕转基因植物的争议也是层出不穷。建立简单、快速，成本低廉的检测方法能够更好保证相关贸易的顺利进行，也可以更加高效的阻止非法转基因植物流入我国。 注：1为转基因玉米MON89034，2为四季豆，3为大豆，4为玉米，5为花生，6为白云豆，7为豌豆，8为燕麦，9为荞麦，10为马铃薯，11为扁豆，12为番茄，13为核桃，14为大杏仁，15为绿豆，16为蚕豆，17为转基因水稻KMD，18为转基因大豆DP305423，19为基因大豆DP305423，20为转基因油菜RT73，21为转基因大豆GTS-40-3-2，22为豇豆，23为转基因玉米MIR604，24为转基因玉米EVENT98140，25为转基因玉米BT176，26为转基因玉米MON810，27为转基因大豆A5547-127，28为H2O。自从PCR于1985年发明以来，有关核酸（DNA）的检测多采用PCR法。目前检测转基因成分的主要方法是荧光PCR法。然而，需要昂贵的荧光PCR仪也是荧光PCR法检测转基因成分的缺点[12]。近几年，尽管有很多非PCR方法检测目的基因的方法被报道。但是，能够达到与PCR法相同检测限的方法很少[3]。该方法检测限为0.5%，能够满足日常检测的限量要求（欧盟和英国0.9%，巴西4%，澳大利亚和新西兰1%，俄罗斯、中国香港、日本、中国台湾5%，韩国和马来西亚3%）。

已经有报道采用LAMP法检测不同品系的转基因植物如转基因大米BT63，KMD和KF6[13]，转基因大豆GTS 40-3-2[14]，转基因玉米Bt176[15]。但是，对于含有多种原料的食品（饼干、面包、），很难逐一品系进行检测。这时筛选检测则是较好的选择。转基因筛选检测常用的目的基因包括：CaMV35S、NOS、NPTII和FMV35S等。FMV35S基因是植物遗传操作常用标记基因，可以作为一个重要的指标判定食品和饲料中是否含有转基因成分。

试验建立了一种检测食品和饲料中FMV35S转基因成分的LAMP方法。与经典PCR法相比，LAMP法更加快速、易操作，检测结果肉眼可见，不需要复杂的检测仪器。该方法的检测限为0.5%，特异性和稳定性满足日常检测要求，对食品和饲料中日常的快速筛检转基因成分有重要的意义。

食品和饲料中转基因植物FMV35S启动子环介导等温扩增检测方法的建立参考文献

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责任编辑 李占东 责任校对 况玲玲