无硝干腌肉制品中锌—原卟啉Ⅸ形成的研究进展

胡宏海　张泓

摘 要：对无硝干腌肉制品中锌-原卟啉Ⅸ形成的研究进展进行了较为系统的阐述。锌-原卟啉Ⅸ是无硝干腌肉制品中的主要红色色素，研究结果表明其生成量与工艺条件密切相关，通过优化工艺参数可促进肉制品中锌-原卟啉Ⅸ，但其形成机制还尚待进一步阐明。

关键词：干腌肉制品； 亚硝基肌红蛋白；锌-原卟啉IX；硝酸盐

Recent Progress in the Research of Zinc Protoporphyrin IX Formation in Nitrite-Free Dry-Cured Meat Products

HU Hong-hai， ZHANG Hong*

（Institute of Agro-products Processing Science and Technology， Chinese Academy of Agricultural Sciences， Beijing 100193， China）

Abstract： This paper systematically reviews recent progress in the research of zinc protoporphyrin IX formation in nitrite-free dry-cured meat products. Zinc protoporphyrin Ⅸ is the principal red pigment in dry cured meat products without nitric， and its formation has been considered closely related to processing conditions. Under optimized process parameters zinc protoporphyrin Ⅸ formation can be promoted in meat products， but its formation mechanism remains to be further elucidated.

Key words： dry-cured meat products； nitrosylmyoglobin； Zn-protoporphyrin IX； nitrate

中图分类号：TS207.3 文献标志码：A 文章编号：1001-8123（2014）05-0037-04

肉与肉制品的色泽是重要的品质评价指标，直接影响消费者对产品适口性的感官认知。在肉制品腌制过程中添加硝酸盐和亚硝酸盐可形成最佳的色泽。通常，腌肉制品的红色色泽源于亚硝基肌红蛋白，是在内源性酶或还原剂的作用下，亚硝酸盐与肌肉中的肌红蛋白反应生成的。但是，肉制品中添加的亚硝酸盐在加工和烹饪过程中会生成亚硝胺，对人体健康有害[1]。因此，如何使用替代物以获得肉制品的稳定色泽成为肉品加工领域的研究热点[2]。由于帕玛火腿等干腌肉制品在腌制过程中不添加硝酸盐或亚硝酸盐的条件下亦可形成稳定的红色色泽[3-6]，许多学者就帕玛火腿等无硝干腌肉制品中的色泽形成进行了广泛的研究[7-11]。最近研究发现，帕玛火腿中的亮红色是由锌-原卟啉Ⅸ所引起的[12-15]。

1 锌-原卟啉Ⅸ的化学特性

源自意大利北部的传统干腌火腿被称作帕玛火腿，以整猪腿为原料，仅添加主要成分为氯化钠的海盐，其稳定的亮红色是在不添加硝酸盐或亚硝酸盐的情况下产生的。Wakamatsu等[12]采用扫描电镜/能量弥散X光仪（scanning electron microscopy with energy dispersive

X-ray，SEM-EDX）分析发现，帕玛火腿中红色色素的固相提取纯化物中含有锌而不含铁。结合质谱分析结果，可推断帕玛火腿中的红色色素物质是锌-原卟啉Ⅸ，其化学结构如图1所示。锌-原卟啉Ⅸ与大家熟知的肌红蛋白衍生物不同，对光稳定性强。Parolari等[16]报道无亚硝酸盐干腌肉制品会产生亲脂性的稳定红色色素，其疏水性随着成熟时间而增加。最新研究结果表明，锌-原卟啉Ⅸ不仅存在于帕玛火腿中，也存在于其他肉制品中。通过比较帕玛火腿和伊比利亚火腿提取物的质谱图发现，两者均检出同样的锌-原卟啉Ⅸ特征峰，由此可见，锌-原卟啉Ⅸ是不添加硝酸盐/亚硝酸盐的干腌肉制品色泽的重要贡献者[17-20]。

图 1 锌-原卟啉Ⅸ的化学结构[12]

Fig.1 Structure of zinc protoporphyrin IX[12]

2 锌-原卟啉Ⅸ形成的研究进展

2.1 模拟体系中培养条件对锌-原卟啉Ⅸ形成的影响

Wakamatsu等[14]在模拟体系中探讨了各种培养条件对锌-原卟啉Ⅸ形成的影响。模拟体系由0.1%肌红蛋白和20%猪肉匀浆物组成，无氧条件下25 ℃培养反应一定时间后，测定其75%丙酮萃取液的荧光强度，结果发现模拟体系中的锌-原卟啉Ⅸ的生成量随着反应时间的增加而增加。在添加叠氮化钠、抗生素以及乙基汞硫代水杨酸钠等抑菌剂的条件下，也能形成锌-原卟啉Ⅸ。同时，经一定温度和时间的预热处理后，肌肉匀浆物中的锌-原卟啉Ⅸ生成量降低。以上结果表明，无氧条件有利于不添加硝酸盐或亚硝酸盐的肉制品中锌-原卟啉Ⅸ的形成，同时外源酶和微生物也与锌-原卟啉Ⅸ的形成有关。

图 2 无氧培养时间对锌-原卟啉Ⅸ生成的影响[17]

Fig.2 Effects of anaerobic incubation time on the formation of Zinc Protoporphyrin IX[17]

2.3 酸的种类、pH值及微生物对无硝色拉米中锌-原卟啉Ⅸ形成的影响

使用不同种类的有机酸调节猪肉匀浆物的pH值后，再加入抗生剂培养反应一定时间，测定其中锌-原卟啉Ⅸ的生成量，同时对培养反应后的菌相变化进行了解析。同时，使用猪肘肉为原料制作色拉米，探讨了添加有机酸对锌-原卟啉Ⅸ形成、色泽、微生物菌相的影响。研究结果表明，不同的有机酸种类、pH值条件下，锌-原卟啉Ⅸ的形成量不同。通过添加有机酸，可促进色拉米中锌-原卟啉Ⅸ的形成，改善其色泽，同时影响微生物菌相变化。由此可见，通过有机酸和pH值的有机结合，调节肉制品中菌群结构，可促进无硝肉制品中锌-原卟啉Ⅸ的形成，改善肉制品色泽。

2.4 一氧化氮（NO）对锌-原卟啉Ⅸ形成的影响

已有研究表明，添加亚硝酸盐等腌制剂的肉制品中未发现锌-原卟啉Ⅸ[17，21-22]，这可能是由于亚硝酸盐在肉制加工过程中会形成一氧化氮（NO）所致，但其抑制机理尚未阐明。Grossi等[23]发现在模拟体系中添加亚硝酸盐会抑制锌-原卟啉Ⅸ的形成，同时认为锌-原卟啉Ⅸ是经由原卟啉Ⅸ产生的，而非来自于血红素。通过验证试验发现，添加SNAP或DETA NONOate等一氧化氮供体可显著抑制锌-原卟啉Ⅸ和原卟啉Ⅸ的形成（图3），且由于DETA NONOate所产生的一氧化氮量大于SNAP，因此DETA NONOate对锌-原卟啉Ⅸ和原卟啉Ⅸ生成的抑制效果较强[24]。通常认为亚铁螯合酶（Ferrochelatase）可促进铁和锌与原卟啉Ⅸ发生螯合反应，NO对锌-原卟啉Ⅸ和原卟啉Ⅸ生成的抑制作用可能是由NO阻害亚铁螯合酶活性引起的，其详细机理还有待进一步研究。

图 3 一氧化氮对锌-原卟啉Ⅸ和原卟啉Ⅸ形成的影响[26]

Fig.3 Effect of nitric oxide on the formation of zinc protoporphyrin IX and protoporphyrin IX in model solutions[26]

2.5 酶触反应及非酶触反应对锌-原卟啉Ⅸ形成的影响

Becker等[25]系统研究了由肌红蛋白、原卟啉生成锌-原卟啉Ⅸ的过程中，不同因素对酶促反应及非酶促反应速率的影响，以期揭示锌-原卟啉Ⅸ形成的分子机理，开发新型无硝干腌肉制品加工技术。帕玛火腿中参与金属转移反应的金属离子包括锌、铁等，肌肉和未经调理的肉品中Zn2+、Fe2+及Fe3+的含量很低。通常，锌、铁等金属离子会和肌肉中蛋白质结合，同时在螯合剂的调控作用下，金属转移反应会被促进或阻止。磷酸盐是常用的肉品加工添加剂，亦是肉中自由金属离子的强力螯合剂，研究表明磷酸盐可促进肌肉匀浆和帕玛火腿中锌-原卟啉Ⅸ的形成。而EDTA作为Zn2+的强力螯合剂，会与其发生络合反应，限制Zn2+的转移，从而阻害锌-原卟啉Ⅸ的形成。适当浓度的食盐可促进肌肉匀浆中锌-原卟啉Ⅸ的形成，较高浓度的食盐会完全阻止锌-原卟啉Ⅸ的形成。另外，在丙酮：水溶液系统中∶考察了基于非酶促反应的锌-原卟啉Ⅸ的形成过程，发现该过程是一个可逆反应，其二阶速率常数为0.63 mol/（L·s（35 ℃）），所需活化能为98 kJ mol/L。同时，通过添加Pb（II）或

N-methylmesoporphyrin等亚铁螯合酶抑制剂考察了亚铁螯合酶对锌-原卟啉Ⅸ形成的作用，结果表明，酶促反应是肉品腌制前期中锌-原卟啉Ⅸ形成的主要途径，但随着酶的失活，非酶促反应变得更加重要。同时发现，亚硝酸盐既可抑制酶促反应亦可抑制非促酶反应，从而阻害锌-原卟啉Ⅸ的形成，其原因可能是亚硝酸盐或由亚硝酸盐与肌红蛋白反应所形成的一氧化氮可阻害作为酶促反应基质的铁-原卟啉Ⅸ发生分离，或者在非酶促反应过程中与Zn（II）发生反应。

2.6 蛋白质水解对锌-原卟啉Ⅸ形成的影响

Grossi等[25]利用高分辨核磁共振仪检测火腿提取物的成分变化，结果发现在帕玛火腿的成熟过程中，甘油、游离氨基酸等含量不断增加，这是由于火腿中存在脂肪水解酶和蛋白水解酶所致[26]。实验结果表明，即使在火腿成熟后期，内源性组织蛋白酶仍有活性，可引起蛋白质水解。同时发现，伴随着火腿中小分子肽的增加，锌-原卟啉Ⅸ的生成量也不断增大。电子自旋共振（electron paramagnetic resonance，EPR）检测发现，火腿生产初期，高氧肌红蛋白的浓度较高，随着成熟时间的推移，高氧肌红蛋白逐渐变成不稳定的部分水解的亚铁肌红蛋白，释放出来的铁形成非血红素胶状氢氧化铁。由此推测，对于由金属置换所导致的锌-原卟啉Ⅸ形成而言，肌红蛋白的水解和无机三价铁沉淀是其必须条件。

2.7 锌-原卟啉Ⅸ的形成机理预测模型

图 4 锌-原卟啉Ⅸ的形成机理预测模型[28]

Fig.4 Suggested mechanism of zinc protoporphyrin IX formation[28]

锌-原卟啉Ⅸ被认为是通过金属转移反应产生的，肌红蛋白中原卟啉环中的Fe（Ⅱ）被zinc（Ⅱ）所替代，但锌-原卟啉Ⅸ的形成机理仍未解明，其可能的3个途径为：1）非酶触反应：厌氧条件下Zn2+替代Fe2+，该过程受氧气、亚硝酸盐、一氧化氮及加热等因素影响；2）内源性亚铁螯合酶触反应：该酶活性在成熟过程中逐渐减弱，而且不同肌肉组织中该酶活性不同；3）微生物酶触反应：引起包括血红素在内的肌肉蛋白水解，从而导致金属离子置换[3-4，7]。其他实验结果表明，由内源性亚铁螯合酶（Ferrochelatase）所引起的金属离子置换反应可产生具有高荧光性的锌-原卟啉Ⅸ色素[24，27]。另外，锌-原卟啉Ⅸ色素也可能由非酶促金属化反应引起，锌（Ⅱ）自动可进入原卟啉Ⅸ环中。在中性条件下游离铁离子会自动氧化为三价铁离子，当有氨基酸和磷酸盐等螯合剂的存在时，会在肌肉中成为胶体铁（Ⅲ）（图4）。这对于防止二价铁把原卟啉Ⅸ环中的锌（Ⅱ）置换出来至关重要。而且胶体铁（Ⅲ）形成可消耗可溶性铁离子（Ⅱ）/（Ⅲ），防止脂肪和蛋白质氧化。

3 结 语

肉与肉制品的色泽是重要的品质评价指标，通常通过添加硝酸盐或亚硝酸盐以获得诱人的肉制品色泽，但随着我国居民对健康、美味、安全、方便的食品需求的不断增长，无硝/低硝肉制品已成为肉品加工领域的研究重点方向之一。帕玛火腿等干腌肉制品在不添加硝酸盐/亚硝酸盐的条件下可形成亮红色的锌-原卟啉Ⅸ色素，但其形成机制尚未阐明。今后，需进一步研究肉制品中锌-原卟啉Ⅸ的形成机制，为开发健康美味的低硝/无硝肉制品提供理论基础。

参考文献：

[1] SKIBSTED L H. Nitric oxide and quality and safety of muscle based foods[J]. Nitric Oxide： Biology and Chemistry， 2011， 24： 176-183.

[2] PEGG R B， FISCH K M， SHAHIDI F. The replacement of conventional meat curing with nitrite-free curing systems[J]. Fleischwirts Chaft， 2000， 80： 86-89.

[3] PAROLARI G， BENEDINI R， TOSCANI T. Color formation in nitrite-free dried hams as related to Zn-protoporphyrin IX and Zn-chelatase Activity[J]. Journal of Food Science， 2009， 74： C413-C418.

[4] WAKAMATSU J， NISHIMURA T， HATTORI A. A Zn-porphyrin complex contributes to bright red color in Parma ham[J]. Meat Science， 2004， 67： 95-100.

[5] PAROLARI G. Review： achievements， needs and perspectives in dry cured ham technology： the example of Parma ham[J]. Food Science and Technology International， 1996， 2（2）： 69-78.

[6] SAKATA R. Studies on physicochemical characteristics of red pigments in meat products[J]. Animal Science Journal， 2000， 71（1）： 1-16.

[7] WAKAMATSU J， OKUI J， HAYASHI N， et al. Zn protoporphyrin IX is formed not from heme but from protoporphyrin IX[J]. Meat Science， 2007， 77： 580-586.

[8] ADAMSEN C E， M?LLER J K S， PAROLARI G， et al. Changes in Zn-porphyrin and proteinous pigments inItalian dry-cured ham during processing and maturation[J]. Meat Science， 2006， 74： 373-379.

[9] MORITA H， NIU J， SAKATA R， et al. Red pigment of Parma ham and bacterial influence on its formation[J]. Journal of Food Science， 1996， 61（5）： 1021-1023.

[10] ISHIKAWA H， YOSHIHARA M， BABA A， et al. Formation of zinc protoporphyrin IX from myoglobin with pork loin extract[J]. Journal of the Faculty of Agriculture Kyusyu University， 2006， 51： 93-97.

[11] ISHIKAWA H， YOSHIHARA M， BABA A， et al. Formation of zinc protoporphyrin IX from myoglobin in porcine heart extract[J]. Food Science and Technology Research， 2006， 12： 125-130.

[12] WAKAMATSU J， ITO T， NISHIMURA T， et al. Direct demonstration of the presence of zinc in the acetone-extractable red pigment from Parma ham[J]. Meat Science， 2007， 76： 85-387.

[13] GABBA L， PAROLARI G. Contribution of the Zn-protoporphyrin IX complex to colour development in typical Italian ham[J]. Industria Conserve， 2005， 80， 173–181.

[14] WAKAMATSU J， OKUI J， IKEDA Y， et al. Establishment of a model experiment system to elucidate the mechanism by which Zn-protoporphyrin IX is formed in nitrite-free dry cured ham[J]. Meat Science， 2004， 68： 313-317.

[15] M?LLER J K S， ADAMSEN C E， SKIBSTED L H. Spectral characterisation of red pigment in Italian-type dry-cured ham. Increasing lipophilicity during processing and maturation[J]. European Food Research and Technology， 2003， 216： 290-296.

[16] PAROLARI G， GABBA L， SACCANI G. Extraction properties and absorption spectra of dry cured hams made with and without nitrate[J]. Meat Science， 2003， 64： 483-490.

[17] ADAMSEN C E， M?LLER J K S， LAURSEN K， et al. Zn-porphyrin formation in cured meat products： effect of added salt and nitrite[J]. Meat Science， 2006， 72： 672-679.

[18] WAKAMATSU J， ODAGIRI H， NISHIMURA T， et al. Quantitative determination of Zn protoporphyrin IX， heme and protoporphyrin IX in Parma ham by HPLC [J]. Meat Science， 2009， 82： 139-142.

[19] M?LLER J K S， ADAMSEN C E， CATHARINO R R， et al. Mass spectrometric evidence for a zincporphyrin complex as the red pigment in dry-cured Iberian and Parma ham[J]. Meat Science， 2007， 75： 203-210.

[20] MORITA H， NIU J， SAKATA R， et al. Red pigment of parma ham and bacterial influence on its formation[J]. Journal of Food Science， 1996， 61（5）： 1021-1023.

[21] LAURSEN K， ADAMSEN C E， LAURSEN J， et al. Quantification of zinc-porphyrin in dry-cured ham products by spectroscopic methods： comparison of absorption， fluorescence and X-ray fluorescence spectroscopy[J]. Meat Science， 2008， 78： 336-341.

[22] TAKETANI S， ISHIGAKI M， MIZUTANI A， et al. Heme synthase （ferrochelatase） catalyzes the removal of iron from heme and demetalation of metalloporphyrins[J]. Biochemistry， 2007， 46： 15054-15061.

[23] GROSSI A B， DO NASCIMENTO E S P， CARDOSO D R， et al. Proteolysis involvement in zinc–protoporphyrin IX formation during Parma ham maturation[J]. Food Research International， 2014， 56： 252-259.

[24] WAKAMATSU J， HAYASHI N， NISHIMURA T， et al. Nitric oxide inhibits the formation of zinc protoporphyrin IX and protoporphyrin IX[J]. Meat Science， 2010， 84： 125-128.

[25] BECKER E M， WESTERMANN S， HANSSON M， et al. Parallel enzymatic and non-enzymatic formation of zinc protoporphyrin IX in pork[J]. Food Chemistry， 2012， 130： 832-840.

[26] KOUTINA G， JONGBERG S， SKIBSTED L H. Protein and lipid oxidation in Parma ham during production[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry， 2012， 60： 9737-9745.

[27] BENEDINIA R， RAJA V， PAROLARI G. Zinc-protoporphyrin IX promoting activity in pork muscle[J]. LWT， 2008， 41： 1160-1166.